T4 DNA Ligase를 사용한 DNA 단편의 ligation 반응 결과의 예

제품설명

본 효소는 인접한 DNA의 5'-P말단과 3'-OH말단을 phosphodiester 결합으로 연결하는 효소이다. 보조인자로 ATP를 필요로 하고, 반응 중간산물로 enzyme-ATP complex가 만들어져 이것이 DNA에 작용한다. 본 효소는 돌출말단 (cohesive end), 평활말단 (blunt end)을 연결하는 활성을 가진다. 또한 극히 낮지만 DNA와 RNA, RNA끼리도 연결하는 활성을 가지고 있다.

보존

-20℃

농도

350 U/㎕

형태

10 mM	Tris-HCl (pH7.5)
50 mM	KCl
1 mM	DTT
0.1 mM	EDTA
50％	Glycerol

첨부 buffer 조성 (10x)

660 mM	Tris-HCl (pH7.6)
66 mM	MgCl₂
100 mM	DTT
1 mM	ATP

활성의 정의

6 ㎍/20 ㎕의 λDNA-HindIII 분해물을 16℃에서 약 30분동안 90% 이상 ligation 시키는 효소 활성을 1 U로 한다.
본 효소의 1 U는 ATP-PPi교환 반응의 0.008 Weiss Unit에 해당한다.
[Weiss Unit 측정용 반응액 조성]

66 mM	Tris-HCl (pH7.6)
6.6 mM	MgCl₂
10 mM	DTT
66 μM	ATP
3.3 μM	[ ³²P] Na ₄P ₂O ₇

순도

-2000 U의 본 효소와 1 ㎍의 λDNA-HindIII 분해물을 37℃, 16시간 반응하여도 전기영동 패턴에는 변화가 일어나지 않는다.
-2000 U의 본 효소와 1 ㎍의 supercoiled pBR322 DNA를 37℃, 16시간 반응하여도 전기영동 패턴에는 변화가 일어나지 않는다.
-2000 U의 본 효소와 1 ㎍의 16S, 23S rRNA를 37℃, 16시간 반응하여도 전기영동 패턴에는 변화가 일어나지 않는다.

활성 측정용 반응제 조성

66 mM	Tris-HCl 완충용액 (pH7.6)
6.6 mM	MgCl₂
10 mM	DTT
0.1 mM	ATP
6 ㎍/20 ㎕	λDNA-HindIII 분해물

사용상의 주의

Ligation 반응은 말단 염기서열의 종류에 따라 반응 속도가 다르다. 일반적으로 다음과 같은 경향이 있다.

돌출말단(cohesive end) ligation
HindIII＞ Pst I＞ EcoRI＞ BamH I＞ Sal I
(Hind III site는 Sal I site보다 10~40배 빠르게 Ligation한다)
평활말단(blunt end) ligation
Hae III＞ Alu I＞ Hinc II＞ Sma I
(Hae III site는 Sma I site보다 5~10배 빠르게 Ligation한다)
EcoR V＞ Sca I＞Pvu II＞ Nru I

용도

-Insert와 DNA와 vector DNA와의 연결
-DNA 단편 간의 연결 또는 어댑터 DNA와의 연결

기원

Escherichia coli carrying the plasmid that encodes the gene of T4 DNA ligase

일반적 성질

- 분자량: 약 62,000
- 소단위: single polypeptide
- 최적 pH: pH7.6 (pH7.2~pH7.8, Tris-HCl)
(pH6.9로 46%, pH8.0에서 65%에 활성 저하)
- 보조 인자: ATP
- 활성화제
2가 양이온: Mg²⁺ (최적농도: 10mM)
환원제: DTT, 2-mercaptoethanol
(2-mercaptoethanol이 더 효과가 크다.)
- 저해제
dATP (길항 저해제)
고농도 일가 양이온: 200 mM Na⁺, 200 mM K⁺
(10% 폴리에틸렌글리콜 (PEG)이 존재할 때는 반대로 활성화 작용을 보인다.)
다당류: heparin, carrageenan

T4 DNA Ligase와 E. coli DNA Ligase 특성 비교

	T4 DNA Ligase	E. coli DNA Ligase
분자량	약 62,000	약 77,000
최적 pH	7.2~7.8	7.5~8.0
조효소 (coenzyme)	ATP	NAD
환원제	필요	불필요
평활말단의 연결	가능	불가능 (+PEG로 가능)
돌출말단의 연결	가능	가능

10 x ligation buffer ^*1	2 ㎕
Vector	50 ng
Insert	vector : insert = 1:1~1:10 사이에서 검토^*2
T4 DNA ligase (350U/㎕)	1㎕
D.W	Up to 20 ㎕
Total	20 ㎕