높은 민감성으로 모든 his-tag을 검출할 수 있다. Universal His Western Blot Kit 2.0은 his-tagged protein 검출을 위한 가장 특이적인 Western blot kit이다. 이것은 6 x His, HAT, 6 x HN tag을 포함한 모든 his tag을 매우 낮은 background로 민감하게 검출할 수 있다.
No Antibodies
검출법은 TALON Metal Affinity Resin에 기반을 두고 있으며, his-tagged protein과 높은 특이성과 친화력을 이용하고 있다. 반응과 세척 후, 검출 시약은 horseradish peroxidase (HRP)와 결합된 streptavidin에 결합되고, 결합하지 않은 시약은 다시 씻어낸다. HRP conjμgate와 반응하는 화학발광 (chemiluminescence) 기질을 첨가하여 his-tagged protein을 시각화한다. 화학발광 (chemiluminescence) 신호는 autoradiography나 phosphorimager를 사용하여 검출할 수 있다 (Figure 1). 전체 과정은 blocking 후 4 시간 안에 완료되며, colorimetric 검출을 이용한 방법으로 변형시킬 수 있다.
일반적인 Western Blot 개선
Universal His Western Blot Kit 2.0는 his-tag 검출을 위한 항체 기반의 Western blot 방법보다 좀 더 특이적이다 (1). 일반적인 Western 검출 기법은 더 높은 비특이적 background를 만들어내는 2차 항체 사용이 필요하다. Clontech의 검출 시약은 다양한 his-tag에 결합하기 때문에 어떤 his-tag과도함께 사용할 수 있고 같은 Western blot 상의 다른 his-tag과 결합하고 있는 하는 단백질도 검출할 수 있다.

본 kit는 일반적으로 lane 당 정제된 단백질 2-4 ng이 필요한 다른 Western blot 방법에 비해 정제된 단백질 0.5 ng까지도 검출할 수 있다. Clontech의 화학발광 (chemiluminescence) 검출 시약과 새로운 background 감소제는 세포 자체 용해물에서 조차 낮은 background의 고도로 민감한 결과를 얻게 해준다 (Figure 2). Fiim exposure 시간은 10초~10분 정도로 6 시간 동안 상대적으로 일정한 signal강도를 나타낸다. 따라서 이 시간동안 여러 번 노출시킬 수 있다.
Figure 1. Overview of the Universal HIS Western method.
Figure 2. The Universal His Western Blot Kit 2.0 detects purified 6xHNtagged proteins and 6xHN-tagged proteins in crude extracts. Panel A. Lanes 1-3: 6xHN ClonScript purified protein (10, 25, and 50 ng). Panel B. Lanes 1-3: 5, 25, and 50 μg of total bacterial lysate, from E. coli expressing 6xHN ClonScript protein.
Components & Storage Conditions
각 제품 구성물과 보관조건은 Certificate of Analysis 를 참조하십시오.
References
1. Universal His Western Blot Kit 2.0 (January 2007) Clontechniques XXII(1):24-25.