제품설명

Brevibacillus(Bacillus brevis) 발현시스템은 고효율 분비 발현을 특징으로 하는 단백질 생산 능력이 뛰어난 시스템이다. 이 균은 그람 양성 세균으로 단백질을 대량으로 분비 생산하는 특징을 갖고 있다1, 2). 이 특징을 살려 지금까지 다수의 이종 단백질 생산에 성공해 왔다. 본 시스템에는 다음과 같은 특징이 있고 특히 분비 단백질의 생산 능력을 발휘한다.
본 시스템에 의한 단백질 생산 실적의 일부를 표 1에 나타냈다. 효소, 항원, cytokines 등의 고발현을 달성했으며 이들 모두 활성이 있음을 확인했다. 또, 박테리아, 고세균, 진핵생물 유래의 단백질 생산 실적도 있고 유전자의 유래에 불구하고 높은 실적을 가지고 있다. 특히, 진핵 생물 유래의 분비 단백질은 보통 분자 내에 S-S결합을 통한 구조를 가지고 있으며, 원핵생물의 발현계에서는 일반적으로 생산이 어려운 것으로 알려져 있다. 본 숙주에서는 분비 생산이라는 특징에서 S-S결합을 가진 단백질 효율적으로 생산할 수 있는 것이 확인되고 있다.

또, 본 숙주는 형질 전환 효율이 높기 때문에 복제가 쉽게 이루어진다. 본 시스템에서 채용하고 있는 BIC법 (Brevibacillus In vivo Cloning법)은 매우 간편한 기법으로, PCR 단편을 vector DNA와 혼합하여 형질전환하는 것만으로도 발현 plasmid를 구축할 수 있다.

배양 생산도 간단하다. 목적 단백질의 배양 생산에는 성질이 다른 2종류의 배지를 선택할 수 있다. 분비 발현의 경우 plasmid를 도입한 발현용 숙주를 배지에 식균하고 진동 배양하면 배양상 청으로 목적 단백질이 분비된다. 원심분리로 균사체를 제거함으로써 맑고 깨끗한 단백질 용액을 얻어 이후의 정제 공정도 간편하게 이루어진다.

표 1. Examples of successful heterologous protein expression using the B. choshinensis host expression system

Proteins

Origins

Production(g/L)

References

Enzymes

α-amylase

B. licheniformis

3.7

　

Sphingomyelinase

B. cereus

3

　

Xylanase

B. halodurans

0.2

　

CGTase

B. macerans

5

　

Chitosanase

B. circulans

1.4

　

Hyper thermo-stable protease

A. pernix

0.1

　

Hyper thermo-stable protease

P. horikoshii

0.7

　

PDI

human

1

4)

Antigens

Surface antigen

E. rhusiopathiae

0.9

　

Surface antigen

T. pallidum

0.8

　

Antibodies

VHH(Anti-NDOM)

lama

3

　

scFv(Anti-fluorescein)

mouse

0.2

　

Fab(Anti-erbB)

mouse

0.4

　

Cytokines

EGF

human

7

　

NGF

mouse

0.2

　

IFN-γ

chicken

0.5

6)

TNF-α

bovine

0.4

　

GM-CSF

bovine

0.2

　

GH

flounder

0.2

　

BIC법의 원리- Ligation-independent Cloning Method
pBIC system은 간단한 3단계로 ligation-independent cloning method을 적용할 수 있다. 1) PCR로 insert 생성, 2) insert와 vector를 섞어 Brevibacillus Competent Cells에 형질전환 3) neomycin이 포함된 배지에 plating. 자세한 사항은 User Manual을 참고 바랍니다.


Brevibacillus in vivo Cloning (BIC) method의 개요.


pBIC vector map.

pBIC DNA를 이용하면 이하의 3종류의 발현용 plasmid를 구축할 수 있다.
1) His-tag secreted protein expression: N말단에 AD+6xHis+DDDK(Enterokinase의 인식서열)을 붙인 형태로 분비시킨다.
2) untagged secreted protein expression: 분비 시그널 하류에 목적 유전자를 도입한다.
3) intracellular protein expression: 번역 개시점 ATG의 하류에 유전자를 도입한다.
내용
Brevibacillus Expression System - BIC System (Code HB300)

Component

Amount

pBIC DNA Set (Code HB310), 10 rxns

Linear Vector DNA

　

pBIC1 DNA

5 μg (100 ng/μL)

pBIC2 DNA

5 μg (100 ng/μL)

pBIC3 DNA

5 μg (100 ng/μL)

pBIC4 DNA

5 μg (100 ng/μL)

Control (Insert DNA)

　

BLA

1 μg (80 ng/μL)

Brevibacillus Competent Cells (Code HB116)

Brevibacillus Competent Cells

100 μL x 10

MT medium

1 mL x 10

Solution A

1 mL x 1

Solution B

1 mL x 2


pBIC Vector DNA

Promoter

Portion of the 5′ sequence upstream of the B. choshinensis P22 gene, which provides strong constitutive expression

Secretion Signal

pBIC1: Secretion signal for BbrPI from B. choshinensis

pBIC2: Secretion signal for a cell wall protein from B. brevis

pBIC3: Secretion signal for the P22 gene from B. choshinensis

pBIC4: Modified secretion signal for pBIC2

Terminator

46 bp termination signal inserted downstream from the cloning site

Rep

Encodes a protein related to plasmid replication (derived from pUB110)

Ori

Plasmid replication origin (derived from pUB110)

NmR

Neomycin resistance gene (selection marker)

보존
pBIC DNA Set components는 -20°C에 보관
Brevibacillus Competent Cells, MT medium, Solution A와 Solution B는 -80°C 에 보관