One step RT-qPCR	Two-step RT-qPCR
개요	역전사 반응을 위해 gene-specific primer를 사용하며, 타겟 유전자만 특이적으로 증폭함.	Random hexamer 또는 oligo dT primer 등의 universal primer를 역전사 반응에 사용하여 전체 mRNA에서 cDNA로 합성하므로, 다양한 유전자를 검출할 수 있음
반응액에 포함된 total RNA양이 많은 경우	반응에 다량의 total RNA가 포함되어도 고효율 증폭 가능함.	역전사 반응에 random hexamer를 primer로 사용 시, primer 양이 충분하지 않은 경우 반응성이 저하될 수 있음. 이러한 경우 oligo dT primer가 증폭효율을 높이고 one step RT-qPCR 수준의 결과를 제공할 수 있어, random hexamer primer 보다 oligo dT primer의 사용을 권장함 Note: oligo dT primer에 의해 합성된 cDNA 증폭 시에는 PCR 타겟이 cDNA 3’ 말단에 가깝게 존재해야 함.
강점	하나의 유전자 분석 시	하나의 샘플 내에서 다수 유전자의 발현 분석 시

많은 수의 샘플을 대량 분석 하거나 낮은 빈도로 존재하는 유전자로 정확하게 검출하기 위해서는 one-step RT-qPCR을 추천합니다. Single-tube에서 진행되는 실험인 만큼 실험 중간에 시약을 추가하는 과정이 없어 실험절차가 간단하고 오염의 가능성이 낮다는 장점이 있습니다.

각 실험과정 및 관련 제품은 아래의 overview 페이지를 참고 바랍니다.

• One-step RT-qPCR 특징 및 관련 제품
• Two-step RT-qPCR 특징 및 관련 제품

RT-qPCR 검량선 작성을 위해서는 주로 아래의 두 가지 방법을 사용할 수 있습니다.
1. RNA를 단계 희석하여 역전사 반응 및 Real Time PCR을 진행
2. RT 반응 후 얻어진 cDNA를 단계 희석하여 Real Time PCR을 진행

두 방법은 서로 다른 parameter로 평가하므로 실험에 적합한 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 단계 희석한 RNA 샘플로 검량선을 작성하면 PCR 증폭효율의 차이뿐 만 아니라 RNA 양에 따라 달라지는 역전사반응 효율의 차이도 반영하게 됩니다. 따라서 이러한 검량선에서 결정된 PCR 효율은 실제 효율과 달라질 수 있습니다.

절대정량을 위해서는 역전사반응을 반영하는 것이 매우 중요하므로 단계희석한 RNA를 샘플로 검량선을 작성합니다 (cDNA 희석은 적합하지 않음).

상대정량은 역전사 반응 효율이 다소 다르더라도 housekeeping gene과 같은 reference gene으로 보정할 수 있으므로, 단계희석한 cDNA를 샘플로 검량선을 작성합니다.

Total RNA 샘플안에 포함된 gDNA의 증폭을 피하기 위해서는:

• gDNA 유래 증폭을 구분할 수 있도록 primer 를 디자인 : 크기가 큰 intron 영역을 선택하여 intro의 상류와 하류에 위치하는 exon 부위를 타겟하도록 primer를 디자인합니다. 이러한 방법으로는 사이즈가 큰 intron에 대한 유전체 증폭이 발생할 수 없습니다. Intron의 크기가 작을 때 발생한 gDNA 유래 증폭은 다양한 증폭 크기 (melt curve) 의 결과로 인한 용해 온도 차이에 따라 구별할 수 있습니다.
• Intron이 없거나, 유전체 구조가 밝혀지지 않은 유전자의 경우, total RNA에 DNase I을 처리하여 gDNA를 제거 후 실험합니다.
• gDNA Eraser가 포함되어 있어 2분만에 gDNA를 제거하고 15분간 역전사반응을 진행할 수 있는 PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)의 사용을 권장합니다. 합성된 cDNA는 다카라의 다양한 qPCR premix에 적용할 수 있습니다.

각기 다른 실험조건에서 정확한 normalization에 적합한 하나의 보편적인 housekeeping gene을 꼽을 수는 없고, 사용할 실험 시스템에서 발현 수준이 서로 크게 다르지 않은 housekeeping gene을 선택하는 것이 중요합니다.
예전부터 사용되었던 일반적인 housekeeping gene으로는 GAPDH와 β-actin이 있으나, 최근 몇 년간의 보고에 따르면 이 유전자의 발현도 샘플 유형 및 실험조건 등에 따라 달라질 수 있습니다.
정확한 normalization을 위해 여러가지 housekeeping gene을 동시에 사용하는 것이 현재로서는 가장 신뢰도 높은 접근법이라고 볼 수 있습니다. 여러 housekeeping gene의 발현을 분석하여 가장 낮은 수준의 발현변화를 보이는 유전자를 선택하는 것이 좋으며, 이러한 최적의 유전자를 선택하기 위한 소프트웨어가 개발되어 있습니다 (예: geNorm, BestKeeper 등). 가능하다면, microarray 또는 RNA-seq 발현 프로파일링 데이터에서 추측할 수도 있습니다.
자세한 내용은 아래를 참조바랍니다.
J. Vandesompele, et al. (2002) Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3(7):RESEARCH0034.1-11

가능한 한 실험에 사용할 실제 샘플과 비슷한 형태의 표준 샘플을 사용합니다. 유전자 발현 분석 실험에서는 타겟 유전자가 발현하는 것으로 알려진 샘플에서 준비된 cDNA를 사용하며, genome 분석을 위해서는 genomic DNA를 표준샘플로 사용합니다.
인공으로 제작된 표준샘플 (예: plasmid DNA)는 권장하지 않습니다. Amplicon의 염기서열이 동일하더라도 template 구성의 차이로 인해 PCR 증폭효율이 매우 달라질 수 있습니다 (예: genomic DNA vs. plasmid DNA).

검증된 primer를 이용했을 경우, 이전 실험에서 진행했던 melting curve analysis (Tm 값) 분석값이 참고될 수 있습니다. Tm값이 이전 실험과 현재 실험에 동일하다면 이전 실험과 같은 PCR 증폭산물을 얻었다는 것을 알 수 있습니다. 비록 각각의 PCR 산물이 동일한 Tm 값을 가지더라도 반드시 동일한 PCR 산물이 아닐 수도 있으니 별개의 확인 방법을 사용하여 PCR 산물을 확인해보는 것을 권장합니다.
Primer를 처음 사용할 때는 PCR 증폭산물을 전기영동하여 올바른 사이즈로 증폭되었는 지 확인합니다.

필요한 반복실험 횟수(n)는 실험시스템에 따라 다릅니다. 원칙적으로 실험오차는 상대적으로 클 것으로 예상되므로 더 많은 수의 반복실험을 진행하는 것이 좋습니다.
RT-qPCR에 의한 유전자 발현을 프로파일링할 때, 생물학적 가변성 정도를 확인하기 위해 여러 개의 생물학적 반복실험군을 준비하고, 다수의 RNA 정제를 진행하는 것이 유용합니다.
qPCR과 관련하여 적은 양의 주형을 사용하면 유전자 검출에 필요한 PCR 사이클 수가 늘어나므로 변이 가능성은 더 커집니다. 따라서 이러한 경우 반복실험 횟수를 늘려서 실험합니다.

qPCR의 감도는 사용하는 시약과 primer 등 실험 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 조건이 잘 검토된 시스템에서는 최소 10 copy까지 검출할 수 있는 것으로 알려져 있습니다.

Ct값은 아래의 두 가지 다른 방법으로 산출할 수 있습니다.

    1. Cross point 법: 증폭곡선과 threshold의 교차점을 Ct값으로 결정
    2. 2nd derivative maximum 법: 증폭곡선의 2차도함수 중 최대값을 Ct값으로 결정

후자의 방법은 threshold에 따라 Ct값이 변하지 않아 매우 정밀한 분석을 진행할 수 있고, 기기에 따른 검출 오차를 배재할 수 있습니다.
단, 일부 기기는 상기 두 가지 방법을 임의 선택할 수 없는 경우도 있습니다.

• 절대정량은 유전자 copy 수를 이미 알고 있는 standard sample을 이용하여 미지의 타겟의 절대적인 양 (예를 들어 유전자 copy 수)를 결정하는 정량방법입니다.
• 상대정량은 샘플 간의 상대적인 비교를 위해 사용하는 정량방법입니다.
• 일반적으로 상대정량은 타겟 유전자를 정량하고, reference 유전자 (예를 들면 housekeeping gene)을 동시에 사용하여 normalization을 진행합니다. 상대정량은 대조군 샘플과 미지의 샘플의 유전자 발현 수준을 비교하는 등에 활용할 수 있습니다.