Ligation-independent cloning (LIC) 방법 중의 하나로써, 3’-> 5’ exonuclease 활성을 가지는 In-Fusion^® 효소를 이용해 DNA 단편 간의 상동서열 (약 15 bp)를 융합시켜 cloning하는 기술로, ligase 없이도 쉽고 정확하게 seamless한 산물을 얻을 수 있습니다. 이 기술을 이용하면, single-step만으로 어느 vector라도 원하는 위치에 목적 insert를 방향성 있게 삽입할 수 있습니다.

하나의 insert를 하나의 벡터에 클로닝하는 경우, 최소 95% 이상의 클로닝 효율을 보입니다. 클로닝 효율은 단순히 colony의 개수를 측정하는 형질전환효율 (transformation efficiency)과는 달리, 반응 후에 얻어진 클론이 insert를 얼마나 정확(accurate)하게 포함하고 있는지, 즉 positive colony의 비중을 의미하는 수치입니다.

In-Fusion^® Cloning은 선형화 된 vector (linearized vector)와 vector 양 말단의 상동서열 15 bp가 부가된 cloning insert가 반응에 필요하며, multiple insert를 이용하는 경우 20 bp의 상동서열을 추천합니다.

Homologous한 오버랩 부위는 PCR 증폭 혹은 올리고 합성을 이용해 제작할 수 있으며, 12 nt보다 짧거나 21 nt보다 긴 상동 서열의 사용은 추천하지 않습니다. Translational reading frame은 gene-specific 서열과 vector 상동 서열 사이에 염기를 추가하여 조절할 수 있습니다. 주의해야 할 점은 vector의 상동 서열이 DNA 말단에 반드시 위치해야 하며, 이 점이 준수되지 않는 경우 In-Fusion^® 반응이 일어나지 않을 수 있습니다.

In-Fusion^® enzyme mix는 insert와 vector를 single stranded 5’-overhang으로 만들며, 생성된 overhang 서열이 서로 상보적으로 결합하여 recombinant circular construct를 제작됩니다. Recombinant construct에 생성된 nick은 E.coli competent cell 내에서 수복(repair)됩니다. 이 때, 10⁸ cfu/㎍ supercoiled DNA보다 낮은 transformation efficiency를 보이는 E.coli strain은 추천하지 않으며, Stellar™ Competent Cells (Code 636763)에서 가장 최적의 효율로 산물을 얻을 수 있습니다.
※ In-Fusion^® 반응은 선형의 DNA 분자 간의 공유 결합을 이용하지 않습니다.

In-Fusion^® Snap Assembly는 액상 형태의 효소 master mix를 포함하고 있는 반면, In-Fusion^® Snap Assembly EcoDry는 효소 master mix 1회분으로 분주 및 동결건조 되어 있는 형태로 제공됩니다. EcoDry 제품은 실온에서 보관할 수 있으며, handling을 최소화할 수 있다는 장점이 있습니다.

형태적 차이점을 제외하고, 두 제품 모두 동일한 반응 원리와 15분간의 반응 조건을 이용합니다.

Cloning Enhancer (CE)는 background plasmid DNA나 PCR 반응 후의 잔여물을 제거하는 효소로써, In-Fusion^® 반응을 진행하기 전 PCR 증폭된 산물의 추가 정제를 위해 사용할 수 있습니다.
- Cloning Enhancer (Code 639615)

Cloning Enhancer는 insert PCR 증폭산물이 smear하지 않고 오직 예상되는 사이즈의 단일 밴드 (a single PCR fragment of the expected size)로 증폭되었을 경우에만 추천합니다. 특히, 원하는 위치에 백그라운드 없는 DNA가 증폭되는 PCR 조건과 primer가 갖춰진 경우, 편리하게 high-throughput으로 적용할 수 있습니다.

>Smear한 백그라운드가 보이는 PCR 증폭 산물의 경우, column 타입의 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (Code 9762A) 사용을 권장합니다.

※ In-Fusion^® 반응 시 CE를 첨가하는 것은 불필요하며, 이로 인해 효율이 증가되지 않습니다. CE는 단순히 PCR 증폭 산물의 정제를 통해 성공 확률을 높이기 위해 사용될 수 있습니다.

In-Fusion^® Cloning은 error-free의 fusion construct를 얻는 이상적인 기술입니다.

4,000 개의 각기 다른 clone과 human open reading frames를 이용해 In-Fusion^® Cloning을 진행했을 때, 2% 이하의 매우 낮은 빈도를 제외하고 In-Fusion^® Cloning enzyme은 slippage나 base addition/deletion을 유발하지 않았습니다. 대부분의 sequence error는 특정 insert를 포함하는 clone 전체 혹은 다수에서 나타났으며, primer 합성 오류가 원인으로 확인되었습니다.

In-Fusion^® Cloning master mix는 안정성이 증가되도록 개량되었으며, 희석이 불필요합니다. Liquid type 제품은 -20 °C에서 보관하며, EcoDry type 제품은 실온에서 보관할 수 있습니다.

In-Fusion^® Snap Assembly는 기존의 HD 버전과 동일한 프로토콜과 장점을 제공하면서도, 더 많은 수의 colony를 재현성 있게 얻을 수 있도록 성능이 개선되었습니다. 특히, multiple-fragment cloning과 같은 어려운 실험에서도 높은 효율을 보입니다.

아니요. In-Fusion^® HD Cloning와 사용을 추천하는 CloneAmp HiFi PCR Premix (Code 639298)와 In-Fusion^® Snap Assembly와 사용을 추천하는 PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase (Code R045A) 두 효소는 모두 high-fidelity 성능을 가지며, 신뢰도 있는 결과를 제공합니다.
※ PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase (Code R045A)는 PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase Ver.2 (Code R047A)로 업그레이드 되었습니다. (최고 수준의 정확성은 유지, 고속 PCR 성능 대폭 향상)

In-Fusion^® Snap Assembly는 대부분의 cloning 실험 (single-insert cloning, multiple-fragment cloning, large-vector cloning, site-directed mutagenesis 등)에서 NEBuilder HiFi를 이용했을 때 보다 많은 수의 colony를 형성할 뿐 아니라, 90% 이상의 정확도를 보입니다.
반응 조건 면에서는 multiple-fragment cloning을 위해 In-Fusion^® Snap Assembly는 타 application과 동일하게 15분 반응만이 필요하지만, NEBuilder HiFi는 60분의 반응 시간이 요구됩니다.

In-Fusion^® Cloning 반응에서는 상동 서열 (homologous overlap)이 꼭 필요로 하며, cloning할 vector와 insert가 5’ 말단에 15 bp 서열이 동일해야 합니다. Multiple-fragment cloning을 진행할 때에는 20 bp의 상동 서열을 추천합니다.

Insert의 상동 서열은 선형화 된 vector 말단의 5’ overhang의 15 bp를 포함하는 primer를 이용한 PCR 증폭을 통해 부가할 수 있습니다.

혹은, vector의 inverse PCR 과정에서 insert 말단의 15 bp를 상동 서열을 추가하는 방법을 이용할 수도 있습니다. 만일 50 bp 이상의 oligonucleotide를 insert로 이용하고자 한다면, 고품질의 non-phosphorylated하게 제작된 oligo를 In-Fusion^® Cloning 반응에 사용할 수 있고, 합성 과정에서 인접한 vector 혹은 insert의 상동 서열 15 bp를 포함하도록 제작하여 사용해도 무방합니다.

PCR을 위한 forward primer (5’-> 3’ sense strand)와 reverse primer (5’-> 3’ antisense strand)는 아래의 가이드라인에 부합해야 합니다.

• 각 primer의 3’ 말단은 gene-specific 서열로, 특이적으로 PCR 증폭을 할 수 있도록 18 ~ 25 nt 길이로 디자인한다.
• 각 primer의 5’ 말단은 선형화 된 vector의 혹은 인접한 insert 말단의 15 nt를 상동 서열로 디자인한다. Multiple-insert cloning을 위해서는 상동 서열을 20 nt로 디자인 할 것을 추천한다. 이 때, 상동 서열의 길이가 12 nt보다 짧거나 21 nt 보다 길게 디자인하는 것은 추천하지 않는다. 15 bp의 상동 서열은 꼭 DNA 말단에 위치해야 하며, 그렇지 않은 경우 In-Fusion^® Cloning에 의해 결합되지 않는다.
• (선택) Translational reading frame 혹은 제한효소 자리를 보전하기 위해서, gene-specific 서열과 15 bp의 상동 서열 사이에 염기를 추가할 수 있다.

In-Fusion^®을 위한 PCR primer를 디자인할 때에는 사용자 매뉴얼에서 확인할 수 있습니다. 다카라바이오는 Google Chrome 혹은 Mozilla Firefox와 호환되는 온라인 툴을 제공하고 있으며, 해당 툴에서 single-insert cloning, multiple-fragment cloning, 그리고 mutagenesis를 위한 primer 디자인을 확인할 수 있습니다.

※ PCR primer 디자인 툴은 Internet Explorer에서 지원하지 않습니다.

※ in silico 상에서의 최종 산물을 미리 확인하고자 한다면, SnapGene Viewer를 이용할 수 있습니다.

In-Fusion^® Cloning 반응은 3’ -> 5’ exonuclease 활성을 이용하여, double-strand DNA의 양 말단을 5’ overhang으로 만드는 원리를 이용합니다. 5’ overhang 형태의 DNA 조각들 (insert, 선형화 된 vector)은 말단의 15 bp 상동 서열을 이용해 annealing 됩니다.

Vector는 inverse PCR 혹은 한 개 또는 그 이상의 제한 효소 처리를 통해 선형화 할 수 있으며, blunt end (e.g., HpaⅡ), 5’ overhang (e.g, EcoRⅠ, BamHⅠ), 3’ overhang (e.g., KpnⅠ)을 형성하는 모든 제한 효소가 사용될 수 있습니다.

아래의 이미지에서 제한 효소 처리 후의 각 DNA 형상에 따른 In-Fusion^® 작동 원리를 확인할 수 있습니다.

제한 효소 처리로 5’ overhang된 부분은 15 nt 상동 서열에 포함됩니다. 3’ overhang된 부분은 이를 제외하고 15 nt 상동 서열로 활용합니다. 자세한 사항은 제품 매뉴얼을 확인해 주세요.

Vector의 선형화를 위해 제한 효소 자리는 gene-specific 서열과 15 bp 상동 서열 사이에 nucleotide를 추가하여 보존할 수 있습니다. 다카라바이오에서 제공하는 온라인 툴을 활용하면 이를 선택하여 PCR primer를 디자인 할 수 있습니다.

Reading frame은 primer sequence를 이용해 조절할 수 있습니다. 예를 들어, fusion protein을 생산할 때, 15 bp의 vector 5’ 말단의 상동 서열이 reading frame의 마지막 5개 codon에 일치하는 경우, 바로 목적 유전자 혹은 tag를 cloning하면 STOP codon의 간섭 없이 C-terminus에서 발현하게 됩니다. Reading frame 위치를 조정해야 하는 경우, 1개 혹은 2개의 추가 염기를 15 bp 상동서열 이후에 추가하는 것 만으로 간단하게 완료할 수 있다.

Translational reading frame continuity은 primer 내 gene specific 서열의 길이를 조절하거나 15 bp의 상동서열과 gene specific 서열 사이에 염기를 추가하는 것으로 조절할 수 있습니다.

다카라바이오에서 제공하는 온라인 툴에서는 translational reading frame 조절을 위한 조정 기능을 지원하고 있지 않으므로, 목적하는 실험에서 요구되는 경우 직접 디자인해 주셔야 합니다.

네. Small tag, Kozak sequence, restriction site 등의 external sequence는 In-Fusion^® primer 디자인 시 15 bp의 상동서열과 gene specific 서열 사이에 추가할 수 있습니다.

선형화 된 vector 말단의 상동 서열이 vector 내 존재하더라도, 이 내부 서열을 이용해 재조합 되는 경우는 매우 드물게 발생합니다. 따라서, 상동 서열이 vector 내에 있더라도, 목적하지 않은 최종 산물이 형성될 가능성은 극히 낮습니다.

아니요. In-Fusion^® Cloning에는 인산화 된 oligonucleotide를 사용할 필요가 없습니다.

In-Fusion^® PCR primer는 반드시 desalting으로 정제한 고품질의 oligonucleotide여야 합니다. Gel 혹은 HPLC를 이용한 정제까지는 필요하지 않습니다.

In-Fusion^® Cloning은 어떤 PCR polymerase와도 호환하여 사용할 수 있으며, 3’ overhang 산물도 cloning을 진행할 수 있습니다.

Error-free insert를 위해서는 높은 proofreading 활성을 가지는 polymerase를 사용하는 것이 좋으며, PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase (Code R045A)를 추천합니다. 이 효소는 최대 6 kb의 human genomic DNA, 10 kb의 E. coli genomic DNA, 15 kb의 lambda DNA를 정확하게 증폭할 수 있으며, 2-step 혹은 3-step의 PCR cycle에 모두 호환할 수 있습니다. 뿐만 아니라, GC-rich template에서 매우 낮은 error rate가 확인되었습니다.

아니요. 3’ A-overhang 산물은 In-Fusion^® Cloning 결과에 영향을 미치지 않습니다.

네. 아래는 한 번의 반응으로 5개의 insert를 이용한 multiple-fragment cloning을 성공한 사례가 있습니다.

네. 15 bp의 상동 서열은 인접한 DNA 간에 나누어 부가하여도 됩니다. 다만, insert와 vector의 상동서열을 나누어 부가하고자 한다면, vector는 inverse PCR을 이용해 선형화 하는 경우에만 적용이 가능합니다.

다카라바이오에서 제공하는 온라인 툴에서는 DNA간 상동 서열을 나누어 부가하는 기능을 지원하고 있지 않으므로, 목적하는 실험에서 요구되는 경우 직접 디자인해 주셔야 합니다.

아래 그림은 Fragment 1 (Red)와 Fragment 2 (Blue)의 상동 서열을 나누어 부가한 실험 예시입니다.

네. PCR로 증폭된 DNA는 In-Fusion^® Cloning 반응 전 정제되어야 합니다. PCR을 진행한 후, 전기영동을 통해 원하는 타겟 DN가 증폭되었는지 확인합니다. 이후, 원하는 크기의 DNA가 single band로 확인되는 경우, spin column을 이용한 정제 (TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (Code 9762A) 등) 혹은 PCR 산물 처리 물질 (Cloning Enhancer (Code 639615))를 적용할 수 있습니다. 만일, 전기영동 상에서 비특이적 백그라운드 (smearing 등)나 multiple band가 확인되는 경우, 원하는 크기의 target DNA만 선택하여 gel extraction 과정을 진행합니다. 만약 vector와 insert 모두 비특이적 백그라운드 없이 증폭되었다면, “Appendix A. Quick In-Fusion Cloning Protocol”을 이용해 바로 반응을 진행할 수 있습니다.

• TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (Code 9762A)
  - 가열 없이 agarose gel을 용해할 수 있어, 핵산 손상 방지 및 빠른 정제 과정
  - 백그라운드 PCR 산물이나 이 외 오염으로부터 원하는 크기의 DNA gel extraction 가능
• Cloning Enhancer (Code 639615)
  - Plasmid DNA 혹은 PCR 산물의 백그라운드를 제거해 주는 enzyme mix
  - 백그라운드 smear가 없이, 원하는 크기의 DNA만 포함되어 있는 PCR 산물에 최적
  - PCR 과정에서 원하는 산물만 발생하도록 PCR 조건 및 primer가 최적화 된 경우, high-throughput (HTP)으로 적용하기에 매우 편리함.

※ 대부분의 경우, Cloning Enhancer (Code 639615)를 처리한 후의 추가적인 column purification혹은 gel extraction 과정은 요구되지 않습니다. 하지만, 보다 좋은 cloning 결과를 얻기 위해서는 PCR로 선형화 된 vector의 경우, 목적 산물 외 발생한 PCR 산물을 제거하기 위해, Cloning Enhancer (Code 639615)와 gel extraction 과정을 함께 진행하는 것을 추천합니다.

이 기술은 large fragment의 cloning에 최적화 되어 있습니다. pUC19 vector에 15 kb의 DNA가 insert로 In-Fusion^® Cloning 반응으로 cloning 되었음을 확인하였습니다.

양 말단에 15 bp의 상동 서열을 포함한 50 bp 크기의 synthetic oligonucleotide의 In-Fusion^® Cloning 적용 사례가 있습니다. 50 ~ 150 bp 정도의 짧은 합성 올리고를 In-Fusion^® Cloning에 적용하고자 하는 경우, vector와의 molar ratio를 5 ~ 15:1 비율로 진행할 것을 추천합니다. Molar ratio는 oligo 길이에 따라 최적의 비율을 확인하여 진행하십시오.

※ Non-phosphorylated oligonucleotide는 In-Fusion^® Cloning에 사용될 수 있습니다. 하지만, 본기술은 3’ exonuclease 활성을 이용하기 때문에 terminal 3’ OH가 필요합니다.

모든 선형화 된 vector는 In-Fusion^® Cloning에 적용 가능합니다. Vector의 선형화는 아래의 방법으로 진행할 수 있습니다.

• 하나 혹은 그 이상의 제한효소 처리
  - 효과적인 In-Fusion^® Cloning을 위해서는, vector의 말단이 선형화 된 채로 잘 유지되는 것이 중요하다. 따라서, 높은 효율의 제한효소를 충분한 시간으로 반응시킬 것을 추천한다. 단, overnight의 반응 시간은 추천하지 않는다.
  - Vector 말단의 dephosphorylation은 필요하지 않다. Vector 양 말단의 15 bp 서열이 상보적이지 않은 이상, In-Fusion^® 반응으로 vector가 recircularize되지 않다.
  - 제한 효소를 이용해 선형화 한 vector는 반드시 agarose gel에서 정제해야 한다 (이 때, DNA 손상을 방지하기 위해, 알루미늄 호일로 커버를 씌워줍니다). 전기영동은 선형화 된 vector와 잘리지 않은 circular 형태의 vector와 구분할 수 있도록 반드시 낮은 전압에서 진행한다.
• 원하는 cloning site로부터 inverse PCR
  - 제한 효소를 사용하지 않기 때문에, 원하는 어느 위치라도 선형화가 가능하다.
  - PCR-mediated mutagenesis (deletion, insertion, base change)를 한 번에 적용할 수 있다.
  - Insert와의 15 bp의 상동 서열을 vector에 부가할 수 있다.
  - Inverse PCR 과정에서 vector 서열에 오류가 발생하지 않도록, PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase (Code R045A)와 같이 높은 proofreading 효율을 가지는 PCR polymerase를 사용할 것을 추천한다.
  ※ PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase (Code R045A)는 PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase Ver.2 (Code R047A)로 업그레이드 되었습니다. (최고 수준의 정확성은 유지, 고속 PCR 성능 대폭 향상)
  - Inverse PCR을 통해 선형화 된 vector는 Cloning Enhancer (Code 639615)를 처리할 수 있으며, 목적 산물 외 발생한 PCR 산물이 존재한다면 Cloning Enhancer (Code 639615)와 gel extraction 과정을 함께 진행하는 것을 추천한다.

Vector의 선형화를 위해 사용한 제한 효소 자리는 gene-specific 서열과 15 bp 상동 서열 사이에 nucleotide를 추가하여 보존할 수 있습니다. 다카라바이오에서 제공하는 온라인 툴을 활용하면 이를 선택하여 PCR primer를 디자인 할 수 있습니다.

아니요. In-Fusion^® Cloning은 선형화 된 vector 말단을 탈인산화 할 필요가 없습니다.

네. In-Fusion^® 기술은 single 혹은 multiple DNA fragment 모두 transfer/shuttle vector를 거치지 않고, 1번의 반응 만으로 large vector (예 - 32.6 ~ 36 kb 크기의 adenoviral vectors)에 곧바로 cloning 할 수 있습니다.

네. 다카라바이오는 long terminal repeats (LTRs) 서열을 가지는 lentiviral vector와 retroviral vector 뿐만 아니라 inverted terminal repeats (ITRs) 서열을 가지는 adenoviral vector와 transgene의 cloning에 In-Fusion^® Cloning을 이용하고 있습니다.

아니요. In-Fusion^® Cloning은 선형화 된 DNA 간에 공유 결합을 유도하지 않습니다.

아니요. Circular 형태의 vector는 In-Fusion^® Cloning에 사용될 수 없습니다. Vector는 반드시 제한 효소 처리 또는 inverse PCR을 통해 선형화 되어야 합니다.

아니요. 상동 서열 15 bp는 반드시 vector와 insert 말단에 정확하게 위치해야 합니다. 그렇지 않은 경우, DNA fragment 간 결합이 되지 않습니다.

네. In-Fusion^® Cloning은 single 혹은 multiple base change, deletion, insertion과 같은 mutagenesis를 위해 사용될 수 있습니다.

네. 50 ~ 150 bp 정도의 짧은 합성 올리고를 In-Fusion^® Cloning에 적용하고자 하는 경우, vector와의 molar ratio를 5 ~ 15:1 비율로 진행할 것을 추천합니다. Molar ratio는 oligo 길이에 따라 최적의 비율을 확인하여 진행하십시오.

※ Non-phosphorylated oligonucleotide는 In-Fusion^® Cloning에 사용될 수 있습니다. 하지만, 본기술은 3’ exonuclease 활성을 이용하기 때문에 terminal 3’ OH기가 필요합니다.

네. 하지만, In-Fusion^® Cloning은 DNA 분자 간의 상동 서열의 annealing을 이용하기 때문에, 해당 서열 내의 GC 함량은 고려해야 합니다. GC 함량에 따른 In-Fusion^® Snap Assembly의 반응 효율 차이에 대한 데이터는 없지만, 초기 버전 제품인 In-Fusion^® Advantage를 이용한 반응에서는 아래와 같은 결과를 얻었습니다.

• 15 bp 상동 서열 중 20 ~ 40%의 GC 함량을 가지는 경우, In-Fusion^® 반응 효율에 없거나, 영향이 미미하였다.
• 15 bp 상동 서열 중 60 ~ 80%의 GC 함량을 가지는 경우, In-Fusion^® 반응 효율이 감소한 것을 확인하였다.

In-Fusion^® 효소는 매우 최적화된 효소로 대부분의 실험에서 매우 높은 cloning 효율을 보입니다. Insert와 vector의 일반적인 molar ratio는 제품 매뉴얼 내에서 확인할 수 있습니다.

• 일반적인 single 혹은 multiple fragment cloning 시, insert와 vector의 molar ratio는 2:1로 진행하는 것을 추천한다.
  - Multiple fragment를 이용하는 경우, 각 insert는 모두 정제된 선형화 vector와 2:1의 molar ratio로 반응해야 한다. (예 - 2개의 insert를 사용하는 경우, 2:2:1의 molar ratio)
  - 가장 작은 크기의 insert가 20 ng이 넘지 않도록 나머지 DNA의 양을 계산하며, 이 때의 molar ratio는 2:1이 되도록 한다.
• 150 ~ 350 bp 크기의 small DNA fragment의 cloning을 위해서는 insert와 vector의 molar ratio는 3 ~ 5:1을 추천한다.
• 50 ~ 150 bp 크기의 short synthetic oligo의 cloning을 위해서는 insert와 vector의 molar ratio는 5 ~ 15:1을 추천한다.
  - Non-phosphorylated oligonucleotide도 In-Fusion^® Cloning을 적용할 수 있다. 하지만, 본 기술은 3’ exonuclease 활성을 이용하기 때문에 terminal 3’ OH기가 필요하다.

다카라바이오는 molar ratio, insert 길이 (bp), vector 길이 (bp)를 고려한 insert와 vector의 반응 양을 계산할 수 있는 온라인 툴을 제공하고 있습니다.

In-Fusion^® 반응 시에는 single insert cloning의 경우 15 bp, multiple fragment cloning의 경우 20 bp의 상동 서열을 추천하며, 12 bp 보다 짧거나 21 bp 보다 긴 길이의 상동 서열을 사용하는 것은 추천하지 않습니다.

아니요. 반응 시간을 늘리는 것은 추천하지 않습니다. 긴 시간 반응하게 되면, insert와 vector 말단에 생기는 single-strand region이 길게 형성되며, 이로 인해 상동 서열이 잘 annealing 되지 않아 cloning 효율이 오히려 낮아질 수 있습니다.

In-Fusion^® Cloning 은 최소 10⁸ cfu/㎍ supercoiled DNA 이상의 transformation efficiency를 보이는 bacteria strain과 사용하는 것을 추천합니다.

• Stellar™ Competent Cells (Code 636763)은 일반적인 cloning 목적에 사용될 수 있는 E. coli strain으로, In-Fusion^® Cloning과 사용 시 가장 최적의 효율을 보인다.
  - Stellar™ Competent Cells (Code 636763)은 large vector (예 - BACs, fosmide)나 반복 서열이 많은 (reiterated sequence) (예 - retroviral/lentiviral vector의 LTR (Long Terminal Repeats) 서열, adenoviral vector의 ITR (Inverted Terminal Repeats) 서열 등)의 cloning에 사용 가능함이 확인 되었다.
• TOP10 세포나 같은 유래의 ccdB Survival 2T1R E.coli, 혹은 DH10B, MC1061 등과 같은 strain을 사용하는 것은 낮은 수의 recombinant clone의 결과로 이어질 수 있다. 만일 multiple fragment cloning 혹은 low copy number의 vector를 사용하는 경우, 특히 결과에 큰 영향을 받을 수 있다.

아래와 같은 bacteria strain은 In-Fusion^® Cloning 반응에 추천하지 않습니다.

• E. coli strains lacking recA1 or endA mutations
• E. coli strains engineered for a particular application (e.g., large-scale protein expression)
• Gram-positive bacterial strains
• Bacterial cells carrying nupG (deoR) mutations

※ 만일 In-Fusion^® Cloning과의 호환성이 확인되지 않은 특정 bacteria strain을 불가피하게 사용해야 하는 경우, 반응 산물을 1:5로 희석하는 것이 transformation efficiency 증가에 도움을 줄 수 있습니다.

아니요. Transformation을 위한 반응 산물을 권장 양보다 많이 사용하는 것은 독성으로 나타날 수 있습니다. 50 ㎕의 Stellar™ Competent Cells (Code 636763) 당 희석 및 정제하지 않은 2.5 ㎕의 In-Fusion^® Cloning 반응 산물을 transformation에 사용할 것을 권장합니다.

(선택) 더 많은 양의 transformation을 진행하기 위해서는 권장하는 것과 동일한 비율로 scale up할 수 있습니다.

Negative colony는 5% 미만의 blue colony로 나타나며, white colony는 strain에 따라 약간씩 달라질 수 있습니다. 일반적으로 5% 미만의 white colony가 백그라운드로 관찰될 수 있으며, 내부 분석에 따르면 95% 이상의 colony로부터 원하는 결과를 얻었습니다. 이는 In-Fusion^® 기술이 높은 cloning efficiency를 보임을 나타내며, 총 생성되는 colony의 수와 관계없이 correct colony의 비율은 유지되었습니다.

50 ㎕의 Stellar™ Electroompetent Cells (Code 636765)를 기준으로, 1:5로 희석한 1 ㎕의 In-Fusion^® Cloning 반응 산물을 electroporation 할 수 있습니다.

In-Fusion^® Cloning은 많은 transformation 된 colony를 제공하도록 높은 transformation 효율을 보이며, 95% 이상의 transformants가 정확하게 cloning되는 장점을 모두 가진 all-in-one 시약입니다. 따라서, colony screening을 위해 많은 시간을 들일 필요가 없습니다.

• Primer는 homologous region의 서열이 정확한지, cloning 반응이 효율적이고 정확하게 잘 수행될 수 있는 좋은 품질로 사용되어야 한다.
• 높은 순도의 PCR 산물을 사용하는 것이 성공적인 cloning 반응에 큰 영향을 미치며, TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (Code 9762A) 사용을 권장한다.
• 최소 10⁸ cfu/㎍ supercoiled DNA 이상의 높은 transformation 효율을 보이는 고성능의 E. coli competent cell을 사용할 것을 추천한다. 대부분의 직접 제작한 competent cell은 성능적인 면에서 충분하지 않을 수 있으며, Stellar™ Competent Cells (Code 636763)의 사용을 가장 추천한다.