In-Fusion Cloning은 insert의 양 말단과 선형화된 벡터 (linearized cloning vector)의 양 말단을 융합시켜 연결시키는 매우 효율적인 클로닝 방법입니다 (Ligation-independent cloning method).

하나의 insert를 하나의 벡터에 클로닝하는 경우, 최소 95% 이상의 클로닝 효율을 보입니다. 클로닝 효율은 단순히 콜로니의 개수를 측정하는 형질전환효율 (transformation efficiency)과는 달리, 반응 후에 얻어진 클론이 insert를 얼마나 정확(accurate)하게 포함하고 있는지를 의미하는 수치입니다.

In-Fusion Cloning 반응을 위해서는 cloning insert와 linearized vector의 양 말단 15 bp를 동일하게 맞추어주는 작업이 필요합니다. 15 bp 상동서열은 PCR 증폭을 통하여 insert의 양 말단에 부가할 수 있습니다. In-Fusion Enzyme mix는 cloning insert와 linearized vector의 말단 15 bp 서열을 15bp 길이의 single stranded 5’-overhang으로 만들며, 이렇게 생성된 overhang 서열이 서로 상보적으로 결합하여 recombinant circular construct를 제작합니다. Recombinant construct에 생성된 nick은 E.coli competent cell 내에서 수복(repair)됩니다.


그림. Overview of In-Fusion Cloning Protocol

In-Fusion Cloning은 제품 내 포함된 구성품의 종류에 따라 아래와 같이 분류되어있고, In-Fusion Cloning에 최적화된 competent cell, 정제키트, high-fidelity PCR 효소를 함께 사용하시면 더욱 높은 효율을 기대할 수 있습니다.

[Liquid Type 제품종류]
모든 제품 내에는 5X In-Fusion HD Enzyme Premix, linearized pUC19 Control Vector (50 ng/㎕), 2 kb Control Insert (40 ng/㎕)가 포함되어있습니다.

	구성품
제품종류	CloneAmp HiFi PCR Polymerase	NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up	Cloning Enhancer	Stellar Competent Cells
In-Fusion® HD Cloning Kit
In-Fusion® HD Cloning w/Competent Cells				Yes
In-Fusion® HD Cloning w/NucleoSpin		Yes
In-Fusion® HD Cloning w/Cloning Enhancer			Yes
In-Fusion® HD Cloning Plus	Yes	Yes		Yes
In-Fusion® HD Cloning Plus CE	Yes		Yes	Yes

[동결건조 제품종류]
모든 제품 내에는 동결건조 타입의 효소 In-Fusion EcoDry Mix, linearized pUC19 Control Vector (50 ng/㎕), 2 kb Control Insert (40 ng/㎕)가 포함되어있습니다.

	구성품
제품종류	CloneAmp HiFi PCR Polymerase	NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up	Cloning Enhancer	Stellar Competent Cells
In-Fusion® HD EcoDry Cloning Kit
In-Fusion® HD EcoDry Cloning Kit w/Competent Cells				Yes
In-Fusion® HD EcoDry Cloning Kit w/NucleoSpin		Yes
In-Fusion® HD EcoDry Cloning Plus	Yes	Yes		Yes

In-Fusion HD Cloning Kit는 liquid 형태의 In-Fusion HD Enzyme Premix를 포함하고 있는 반면, In-Fusion EcoDry Cloning Kit는 동결 건조된 In-Fusion HD Enzyme Premix가 8-strip tube에 분주된 형태로 제공됩니다. EcoDry는 실온에서 보관 가능할 뿐만 아니라, 미리 분주되어있으므로 handling error를 최소화할 수 있습니다. Liquid 형태의 경우 15분, 그리고 EcoDry 형태의 경우에는 30분의 반응 시간이 필요합니다.

Cloning Enhancer (CE)는 PCR 반응 후의 잔여물을 제거하는 효소로써, In-Fusion HD Cloning Plus CE 제품에 함께 제공되며, 별도로 구매 가능합니다 (Cloning Enhancer (Code 639615))
Cloning Enhancer는 insert PCR 증폭산물이 오직 단일 밴드 (a single PCR fragment of the expected size)로 증폭되었을 경우에만 추천하며, 일반적으로는 column 타입의 NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up 사용을 권장합니다.

PCR primer의 Forward primer (5' → 3' sense strand)와 Reverse primer (5' → 3' antisense strand)는 각각 아래와 같은 조건을 포함하여 디자인해야 합니다.

• Gene specific 부위 PCR primer 3’ 말단- 특이성과 효율이 높은 PCR 증폭을 위하여 약 18-25 bp의 template-specific 서열을 포함하여야 합니다. 3' 말단 부위는 아래의 조건을 충족해야 합니다.
  - 길이: 18 - 25bp
  - GC 함량: 40 - 60%
  - Melting temperature: 58 - 65℃.
  - Forward와 Reverse primer간의 Tm값 차이: 4℃ 이하
  * Note: Tm 값은 PCR primer 전체 길이가 아니라 3' gene-specific 말단 부위를 기준으로 계산합니다. 만약 Tm값이 너무 낮다면 gene-specific 부위의 서열 길이를 늘려 Tm값이 58 - 65℃로 맞추십시오.
  - 같은 염기서열이 중복 나열되지 않도록 유의하십시오. 각 PCR primer의 3' 말단부위는 두 개 이상의 guanine (G) 또는 cytosine (C)가 포함되지 않도록 디자인하십시오.
  
  
• 15bp overlap 부위 PCR primer 5’ 말단- 상동 재조합 부위 (homologous overlaps)의 서열은 12 bp 이하 또는 21 bp 이상의 길이의 서열은 권장하지 않습니다. 15 bp overlap 서열은 반드시 각 DNA Fragment 말단 부위에 위치하여야 합니다.
  
  
• (Optional) Translation reading frame을 맞추어주기 위하여, 또는 제한효소 사이트를 보존하기 위하여 PCR primer의 template-specific 부위와 15 bp overlap 서열 사이에 추가적인 염기를 부가할 수 있습니다

최적의 상동서열 길이는 15 bp이며, 12 bp 이하 또는 21 bp 이상의 길이는 권장하지 않습니다.

다카라에서는 보다 쉬운 In-Fusion Cloning의 사용을 위하여, 아래와 같은 툴을 제공합니다.

• Primer Design Tool: 본 디자인툴을 이용하면 single cloning, multi-fragment cloning 뿐만 아니라, mutagenesis를 위한 In-Fusion Cloning용 PCR primer를 제작 가능합니다. 본 온라인 툴은 Mozilla Firefox 또는 Google Chrome Web browser에 최적화 되어있으며, Internet Explorer는 권장하지 않습니다.
• Molar Ratio Calculator: In-Fusion Cloning 반응에 최적 조건인 vector, insert molar ratio를 계산해주는 툴입니다
• SnapGene Veiwer: In-Fusion Cloning의 예상되는 반응 산물을 시각화하여 보여줍니다.

Reading frame은 PCR primer 서열 디자인 과정에서 맞춰줄 수 있습니다. 예를 들어, In-Fusion PCR primer 5' 말단 부위의 15 bp overlap 서열이 vector reading frame의 5개의 코돈에 상응한다면, 새로운 유전자나 tag를 3' 말단의 상동서열 부위에 그대로 연결시켜 벡터의 C-terminus의 같은 reading frame downstream에 클로닝할 수 있습니다. Reading frame을 맞춰주기 위해 target gene 부위의 첫 번째, 또는 15 bp 상동서열 뒤쪽에 하나 또는 두 개의 염기를 추가해 줄 수 있습니다.

<예시>

예, 추가할 수 있습니다. Small tags, kozak sequence, restriction site와 같은 external nucleotide sequence를 In-Fusion PCR primer의 15 bp 상동서열과 gene-specific 부위 사이에 추가할 수 있습니다. 자세한 내용은 In-Fusion Cloning Webinar 시리즈를 참고 하십시오.

PCR 반응 산물의 3’ overhang은 In-Fusion Cloning 반응에 영향을 주지 않기 때문에, 시중의 어떠한 PCR 효소도 사용 가능합니다. 하지만, PCR 반응 시의 염기서열 에러 발생을 최소화하기 위하여 CloneAmp HiFi PCR Premix (Code 639298)과 같은 high-fidelity PCR 효소의 사용을 권장합니다. 본 효소는 높은 정확도와 증폭력으로 약 6 kb Human genomic DNA, 10kb E.coli genomic DNA, 15kb Lamda DNA까지 증폭이 가능하며, 2-step, 3-step PCR 반응으로 적용 가능합니다.

* 10 kb 이상의 증폭에는 PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase (Code R050A)를 추천합니다.


그림. Mutation frequency of CloneAmp HiFi Polymerase compared to other high-fidelity PCR enzymes.

예. 다섯 개의 insert fragment를 한번에 클로닝한 사례가 있습니다.
아래의 그림과 같이 두 개의 insert 사이에는 하나의 상동재조합 부위 (homologous overlap)가 위치하여야 합니다. Multiple fragment cloning (이하, Multiple cloning)을 위한 PCR primer는 온라인 프라이머 디자인툴을 이용하였으며, 이에 대한 자세한 디자인 가이드는 Primer Design Tutorial_Cloning Multiple Fragments into a Restriction Digest-Linearized Vector을 참고하십시오.



그림. The In-Fusion HD Cloning System has an improved capability for cloning multiple fragments in a single reaction.  Using this system, cloning up to four 1-kb fragments simultaneously is as easy as cloning a single fragment. This saves weeks that would otherwise be spent screening clones and subcloning.

예. PCR로 증폭한 DNA는 클로닝 반응 전에 반드시 정제해야 합니다. 증폭 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 원하는 크기에서 단일밴드로 확인이 되는 경우, 컬럼 타입 정제키트 (NucleoSpin Gel and PCR Clean Up) 또는 Cloning Enhancer (CE) 중 선택해서 사용할 수 있습니다. 하지만 전기영동 결과 백그라운드 또는 다중밴드 (multiple bands)가 관찰이 되는 경우, 컬럼 타입의 정제 키트를 이용하여 타겟 단일밴드만 분리 정제하기를 권장합니다.
하지만, 전기영동 결과 백그라운드 또는 다중밴드 (multiple bands)가 관찰이 되는 경우, 컬럼 타입의 정제 키트를 이용하여 Target fragment band를 분리하기를 권장합니다.

• NucleoSpin Gel and PCR Clean Up (컬럼타입)
  - PCR 산물이 multiple band를 보이는 경우 원하는 타겟 밴드만 gel extraction
  - PCR 산물이 background smear가 보이지 않는 경우에는 본 제품으로 PCR 산물 정제도 가능
• Cloning Enhancer (CE)
  - PCR 반응 시의 잔여물을 제거하는 효소
  - Gel상에서 background smear 없이 원하는 사이즈에 single band로 확인되는 경우에 사용

In-Fusion Cloning을 이용하여, pUC19 vector에 15 kb insert의 클로닝을 테스트 완료한 바 있습니다.


그림. Ten out of ten colonies contain the correct insert (100% efficiency) when cloning fragments as large as 15 kb (results confirmed by colony PCR screening).

In-Fusion Cloning 테스트 결과, 50 bp synthetic oligonucleotide (vector 말단의 15bp overlap 서열 포함)의 클로닝에 성공한 바 있습니다. 짧은 서열의 synthetic oligos (50 - 150 nt)를 이용하여 In-Fusion Cloning을 진행할 경우, oligo와 vector의 molar ratio는 5 - 15 : 1 로 권장합니다. Oligo의 길이에 따라, 최적의 molar ratio는 달라질 수 있습니다.
* Note: Non-phosphorylated oligonucleotides는 In-Fusion Cloning에 적용 가능합니다. 하지만, In-Fusion Enzyme mix의 3’ exonuclease activity를 위해서는 말단부위의 3’-OH Group이 필요합니다.

In-Fusion Cloning을 이용하면, transfer/shuttle vector를 사용하지 않고 Adenoviral vector (32.6 - 36 kb)와 같은 큰 사이즈의 vector에도 쉽게 single cloning 또는 multiple cloning을 진행할 수 있습니다. Adeno-X Adenoviral System 3 브로셔의 Figure 1, 2, 5와 Table III의 내용을 참조하십시오.

예. In-Fusion Cloning 반응을 이용하여 single & multiple base change (염기변이), deletion (제거), insertion (삽입) 변이에 적용 가능합니다. 다카라에서는 mutagenesis를 위한 In-Fusion PCR primer 디자인툴을 제공하고 있습니다.
상세한 내용은 In-Fusion Webinar 시리즈를 참고 하십시오.

• 일반적인 실험 조건 또는 single, multiple fragment cloning 시, insert : vector = 2 : 1을 권장합니다.
  - Linearized, purified vector에 대하여 각각의 insert fragment의 molar ratio 비율은 2 : 1이 되어야 합니다. 예를 들어, 두 개의 insert cloning일 경우, insert A : insert B : vector = 2 : 2 : 1 권장
• 작은 사이즈의 DNA Fragments (150 bp - 350 bp)를 이용하는 경우, insert : vector = 3 - 5 : 1 권장
• 짧은 길이의 합성 올리고 (50 bp - 150 bp)를 이용하는 경우, insert : vector = 5 - 15 : 1 권장. 하지만, Oligo 길이에 따라서 최적의 molar ratio 길이는 달라질 수 있습니다.
• In-Fusion Cloning 반응 시의 Molar ratio 계산은 Molar Ratio Calculator 온라인툴를 이용하십시오.

In-Fusion 반응 시간을 임의로 늘리는 것은 권장하지 않습니다. 이는 의도치 않은 vector와 insert 말단 사이의 single-strand 부위를 발생시킬 수 있으며, 상동조합의 효율을 떨어뜨릴 뿐만 아니라 전체적인 클로닝 효율을 저하시킵니다. 매뉴얼에서 권장하는 시간을 준수하세요.

In-Fusion Cloning 사용 시, 최소 10⁸ cfu/㎍ supercoiled DNA 이상의 효율을 가진 bacterial cell 사용을 권장합니다.

• Stellar Competent Cell (Code 636763) (일부 In-Fusion Cloning Kit 제품 내 포함)은 In-Fusion Cloning에 최적화 되어있을 뿐만 아니라, 일반적인 클로닝 용도로 이용 가능합니다. - Stellar Competent Cell은 BACs, fosmid와 같은 큰 사이즈의 벡터의 증폭과 클로닝에 validation 되어있을 뿐만 아니라, Retrovirus/Lentivirus의 LTR, Adenovirus의 ITR 부위와 같은 반복되는 서열을 가진 벡터의 클로닝에도 사용 가능합니다.
• TOP10 cell 혹은 그 유도세균 (예를 들어, ccdB Survavial 2T1R E.coli), 또는 연관 박테리아 (예를 들어, DH10B, MC1061)의 경우는 Recombinant clone의 생성률이 비교적 적다고 알려져 있으므로, multiple-fragment cloning 또는 low copy vector를 이용한 cloning 실험에는 권장하지 않습니다.

권장하지 않습니다. User manual 상에서 권장하는 양 이상을 사용할 경우, cell에 독성을 나타낼 수 있습니다. In-Fusion Cloning 반응 산물을 형질 전환 시, Stellar Competent Cell 50 ㎕ 당, 2.5 ㎕ 사용하기를 권장합니다.