CRISPR 실험 가이드 (Tutorial)
A powerful method for engineering your gene of interest
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 기술은 유전자 편집을 위한 혁신 기술로 사람 또는 동 · 식물 세포에서 특정 유전자의 DNA를 인식하는 sgRNA (single-guide RNA)와 핵산분해효소인 Cas9 nuclease를 이용한 기술이다.
다카라바이오는 성공적인 CRISPR/Cas9 Gene Editing을 위한 “Guide-it™ 시리즈”를 제공하고 있다.
CRISPR/Cas9을 위한 핵심 인자
CRISPR/Cas9을 위한 핵심 준비물!
아래의 두 개 또는 세 개의 인자를 세포 내로 도입시켜주면 준비 완료!
① Cas9 nuclease : 목적 DNA를 절단하는 효소
② sgRNA (single-guide RNA) : 편집하고자 하는 부위의 DNA와 상보적으로 결합하는 RNA
③ HDR Donor Template (HDR Template) : 목적 유전자 삽입 혹은 specific mutation을 위한 DNA
아래의 두 개 또는 세 개의 인자를 세포 내로 도입시켜주면 준비 완료!
① Cas9 nuclease : 목적 DNA를 절단하는 효소
② sgRNA (single-guide RNA) : 편집하고자 하는 부위의 DNA와 상보적으로 결합하는 RNA
③ HDR Donor Template (HDR Template) : 목적 유전자 삽입 혹은 specific mutation을 위한 DNA
① + ② → NHEJ Pathway를 이용한 유전자 기능 삭제
① + ② + ③ → HDR Pathway를 이용한 목적 유전자 삽입 혹은 specific mutation editing
① + ② + ③ → HDR Pathway를 이용한 목적 유전자 삽입 혹은 specific mutation editing
CRISPR/Cas9 표준 프로토콜
쉽고 효율적인 CRISPR/Cas9 실험 프로토콜 : Clontech Guide-it™ system
Step 1. sgRNA 제작
목적 유전자 서열과 상보적으로 결합하는 sgRNA 합성과 스크리닝을 통한 효율 검증
Step 2-3. CRISPR Gene Delivery
sgRNA와 Cas9 단백질 또는 HDR template를 다양한 형태 (DNA, RNA, Protein)와 다양한 방법 (transfection, electroporation, viral gene delivery,
Gesicle 외)으로 목적세포에 도입
NHEJ Pathway로 인해 발생된 Indel 변이, 또는 HDR로 삽입된 유전자 또는 SNP를 전기영동 확인 또는 서열 분석
Step 1. sgRNA 제작
목적 유전자 서열과 상보적으로 결합하는 sgRNA 합성과 스크리닝을 통한 효율 검증
Step 2-3. CRISPR Gene Delivery
sgRNA와 Cas9 단백질 또는 HDR template를 다양한 형태 (DNA, RNA, Protein)와 다양한 방법 (transfection, electroporation, viral gene delivery,
Gesicle 외)으로 목적세포에 도입
NHEJ Pathway로 인해 발생된 Indel 변이, 또는 HDR로 삽입된 유전자 또는 SNP를 전기영동 확인 또는 서열 분석
CRISPR 유전자 도입방법
CRISPR 실험을 위한 Cas9, sgRNA 유전자 (+ HDR template)를 세포 내로 도입 시, 다양한 도입방법과 형태를 사용할 수 있다.
CRISPR를 이용한 유전자 편집 방법의 선택 . NHEJ 또는 HDR Pathway 선택
Cas9 nuclease에 의해 절단된 목적유전자는 세포의 DNA 복구시스템 (DNA repair system)에 의해 회복된다. 대표적으로 NHEJ Pathway에 따른 Indel (Insertion and deletion) 생성으로 인한 frame shift 현상은 유전자 Knock-out 결과를 야기한다. HDR template의 존재 하에서는 HDR Pathway가 유발되어 원하는 유전자를 삽입 또는 변형할 수 있다.
CRISPR 유전자 도입방법의 선택 . sgRNA, Cas9 유전자 도입형태의 선택
| 도입형태 | Active Protein (RNP* Delivery) |
DNA Plasmid |
mRNA |
Viral Transduction |
Cas9 nuclease sgRNA |
Plasmid DNA encoding Cas9 and sgRNA |
mRNA encoding Cas9 and sgRNA |
Viral vector encoding Cas9 and sgRNA |
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| 도입방법 |
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| Guide-it™ 주요제품 |
* RNP: Ribonucleoprotein Complex