Homology-directed repair FAQ

HDR template은 ① 도입하고자 하는 서열과 ② Homology arm을 포함하여야 한다. Homology arm은 도입 서열의 5’과 3’ 말단에 위치하며, 편집되는 genome locus와 일치할 수 있도록 wild-type genome locus와 상동 서열로 구성한다.
삽입이나 대체 등을 위해 도입하는 서열은 HDR template 중앙에 위치하도록 디자인한다. HDR template의 정확한 서열은 sgRNA의 위치나 Cas9 nuclease가 작용하는 부위와 관련은 없으나, 효율적인 편집을 위해서 Cas9-sgRNA ribonucleoprotein (RNP)가 절단하는 부위와 근접하여 디자인한다.
아래의 그림은 single nucleotide substitution이나 더 긴 길이의 insert를 삽입하고자 할 때 사용하는 HDR template 디자인 예시를 보여준다.


그림 1. (A) Single nucleotide substitution (B) Insertion을 위한 HDR template 디자인 예
두 경우 모두 HDR template는 목적 위치의 wild-type와 상동한 서열을 5’, 3’ 말단에 반드시 포함해야 한다.
(Panel A) RECQL4 유전자에서 g.1488C>T mutation을 도입할 수 있는 HDR template 디자인 예를 확인할 수 있다. 대체하고자 하는 염기는 붉은색으로 표시되어 있다.
(Panel B) UGT1A9 유전자의 C terminus에 myc tag를 삽입할 수 있는 HDR template 디자인 예를 확인할 수 있다. 이 경우, 3개의 다른 sgRNA를 이용해 목적 위치에 tag를 삽입할 수 있다.

ssDNA를 HDR template으로 사용하면, dsDNA 형태보다 독성이 낮고 genome에 무작위로 integration되는 빈도가 낮다고 알려져 있으며 (Roth et al. 2018; Li et al. 2017), 이는 유전자 편집이 어려운 세포에서 특히 장점으로 발휘될 수 있다. 예로, 목적 세포에서 내인성 유전자에 형광 단백질을 융합하여 발현시키고자 하는 경우, 전체 유전자 편집 세포에서 형광을 발현하는 세포의 비율을 이용하면 성공한 유전자 편집 효율을 확인할 수 있다. 하지만 무작위 integration 빈도가 높다면, 타겟으로 했던 genome 위치가 아닌 다른 위치에서 형광 단백질이 발현됨으로써 결과에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, ssDNA 형태의 HDR template을 사용함으로써 무작위 삽입되는 빈도를 낮추는 등 오차를 최소화할 수 있다.

/ References
- Li, H et al., Design and specificity of long ssDNA donors for CRISPR-based knock-in. bioRxiv doi: https://doi.org/10.1101/178905 (2017).
- Roth, T.L et al., Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nat. Lett. 559, 405-409 (2018).

Single-strand oligo deoxynucleotides (ssODNs)는 화합물 합성을 통해 편리하게 얻을 수 있으며, 목적하는 실험이 single nucleotide substitution이거나 도입하고자 하는 insert 길이가 50 nt 이하로 총 HDR template 길이가 200 nt 이하인 유전자 편집에 사용될 수 있다. 만약, 보다 긴 길이의 insertion을 위해 HDR template의 총 길이가 500 nt 이상인 경우에는 ssDNA를 추천하며, 이는 다카라바이오의 Guide-it™ Long ssDNA Production System v2 (Code 632666) 제품을 이용하여 합성할 수 있다.

Knockin 효율은 HDR template 길이에도 영향을 받는다. ssDNA HDR template의 경우, 350 ~ 700 nt 길이의 homology arm으로 디자인 했을 때 가장 높은 효율을 보임이 확인되었다 (Li et al. 2017). 다카라바이오는 hiPSC를 유전자 편집하는 과정에서 350 nt 길이의 homology arm가 가장 높은 효율을 보임을 확인하였고, 더 긴 길이의 homology arm을 적용했을 때 Knockin 효율에 큰 차이는 없었다.
더 긴 길이의 Homology arm을 사용하게 되면, HDR template의 molecular weight가 증가하게 되고, 따라서 electroporation에 적용 가능한 HDR template의 총 양 (㎍)은 감소하게 된다. 따라서 불필요하게 긴 길이의 homology arm을 이용하면, 반응에 사용할 수 있는 DNA copy 수가 낮아 HDR pathway를 이용하는 유전자 편집 효율에 영향을 미칠 수 있다.

/ References
- Li, H et al., Design and specificity of long ssDNA donors for CRISPR-based knock-in. bioRxiv doi: https://doi.org/10.1101/178905 (2017).

HDR template 내에 PAM이나 sgRNA 인식 부위와 같은 서열을 그대로 포함하고 있는 경우, Cas9-sgRNA RNP는 HDR로 도입된 새로운 genome target에 작용하여 DNA를 절단할 수 있다. 이를 감안해, 일반적으로는 HDR template에 silent mutation을 도입함으로써 Cas9-sgRNA RNP가 HDR template를 인식하지 못하도록 하여 실험 성공률을 높이는 방법이 사용되고 있다.
만약, 실험에 이용하고자 하는 PAM 서열이 코딩 영역에 있고, silent mutation으로 변경할 수 있는 경우라면 이를 진행하여 유전자 편집의 정확도를 높이고, HDR template 내 Cas9 작용과 indel 형성을 방지할 것을 권장한다 (Paquet et al. 2016). RNP의 결합을 막기 위해 PAM 서열을 mutation시킬 때에는 SpCas9이 비교적 덜 인식하는 서열 (NAG 혹은 NGA)나 다른 서열을 인식하는 Cas12a (i.e., TCTA, TCCA, or CCCA)를 고려할 수 있다 (Zhang et al. 2014; Hsu et al. 2013)
이 외에 Protospacer sequence에도 mutation을 도입할 수 있다. 하지만, 일부 sgRNA는 결합하는 서열이 불일치 하더라도 인식하는 경우가 있기에, PAM과 가까이에 위치하고 있는 여러 염기들을 변경할 것을 권장한다 (Paquet et al. 2016; Kwart et al. 2017).
아래 그림은 HDR template 내 PAM mutation을 도입함으로써, 편집 효율을 향상시킬 수 있음을 예시로 보여주고 있다.



그림 2. PAM 서열의 mutation 도입을 통한 유전자 편집 효율 향상
UGT1A9 유전자의 C terminus에 위치한 stop codon 바로 앞에 myc tag (노란색)을 표지하는 실험을 진행했다. 타겟으로 하는 유전자 위치를 인식하도록 sgRNA 3종을 디자인한 후 각각의 효율을 확인했다. Myc tag 서열만을 포함하는 HDR template와 insert와 mutation을 포함하는 HDR template 각각을 RNP complex와 함께 ChiPSC18 세포에 electroporation으로 도입했다. Electroporation이 완료된 후, 각각의 샘플군에서 Guide-it™ SNP Screening Kit를 이용해 seamless하게 목적 tag 서열이 삽입 되었는지 5’, 3’ 말단의 형광 시그널을 검출함으로써 HDR 효율을 분석했다. 함께, myc tag가 삽입되면서 생긴 Ndel 제한효소 인식 부위가 형성되는데, 이를 RFLP 방식으로 검출함으로써 HDR 효율을 추가로 분석했다. 이 분석 과정에서는 sgRNA3과 mutation 서열을 포함하는 HDR template를 사용한 실험 군에서만 결과가 확인되었으며, 이 실험군은 Guide-it™ SNP Screening Kit를 이용해 분석했을 때에도 가장 높은 형광 값을 보였다.

/ References
- Hsu, P. D. et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827-32 (2013).
- Kwart, D., Paquet, D., Teo, S. & Tessier-Lavigne, M. Precise and efficient scarless genome editing in stem cells using CORRECT. Nat. Protoc. 12, 329-354 (2017).
- Paquet, D. et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature 533, 125-129 (2016).
- Yamano, T. et al. Structural Basis for the Canonical and Non-canonical PAM Recognition by CRISPR-Cpf1. Mol. Cell 67, 633-645.e3 (2017).
- Zhang, Y. et al. Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells. Sci. Rep. 4, doi: 10.1038/srep05405 (2014).

HDR template의 삽입 부위는 Cas9-sgRNA RNP가 절단하는 부위의 10 nt 내 위치하는 것을 강력히 추천한다. Wild-type SpCas9의 경우, PAM 서열의 3~4 nt 앞을 절단하게 되며, 이 절단 부위와 HDR template가 멀어질수록 편집 효율이 낮아지는 것이 확인되었다 (Paquet et al. 2016).

/References
- Paquet, D. et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature 533, 125-129 (2016).

Nucleosome은 생체 내에서 SpCas9이 목적 서열을 절단하는 것을 억제한다는 것이 입증 되었으며, 이는 Cas9 활성이 sgRNA 고유 활성 뿐 아니라 chromatin 구조에도 영향을 받음을 시사한다 (Yarrington et al. 2018). DNA 서열이 특정 서열에 indel을 생성하는 중요한 역할을 하지만, chromatin 내로 DNA를 삽입하는 경우, 위치에 따라 indel 생성 효율에 영향을 받을 수 있음이 밝혀졌다 (Chakrabarti et al. 2018). 반면, imprinted gene의 경우에는 chromosome 위치와는 무관한 유전자 편집 결과를 보였다 (Kallimasioti-Pazi et al. 2018).

/ References
- Chakrabarti, A. M. et al. Target-Specific Precision of CRISPR-Mediated Genome Editing. Mol. Cell 73, 1-15 (2018).
- Kallimasioti-Pazi, E. M. et al. Heterochromatin delays CRISPR-Cas9 mutagenesis but does not influence the outcome of mutagenic DNA repair. PLOS Biol. 16, e2005595 (2018).
- Yarrington, R. M., Verma, S., Schwartz, S., Trautman, J. K. & Carroll, D. Nucleosomes inhibit target cleavage by CRISPR-Cas9 in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 115, 9351-9358 (2018).

HDR 효율을 높일 수 있는 새로운 방법은 현재 많은 연구에서 중점적으로 다루고 있다. 현재까지 효율을 높일 수 있을 것으로 보이는 방법은 아래와 같다.

• Aird et al. 2018; Savic et al. 2018; Carlson-Stevermer et al. 2017
  -> Cas9-sgRNA RNP와 template을 융합 혹은 부착
• Gutschner et al. 2016
  -> HDR를 이용한 편집 효율이 가장 높은 S - G2 phase 세포 주기에서만 Cas9 발현 유도
• Rees and Liu 2018
  -> 단일염기치환 (Single nucleotide substitution)을 위한 염기 편집 기술 개발
• Wienert et al. 2018; Riesenberg and Maricic 2018
  -> HDR 효율을 높일 수 있는 다양한 화합물 활용

/ References
- Aird, E. J., Lovendahl, K. N., St. Martin, A., Harris, R. S. & Gordon, W. R. Increasing Cas9-mediated homology-directed repair efficiency through covalent tethering of DNA repair template. Commun. Biol. 1, 54 (2018).
- Carlson-Stevermer, J. et al. Assembly of CRISPR ribonucleoproteins with biotinylated oligonucleotides via an RNA aptamer for precise gene editing. Nat. Commun. 8, 1711 (2017).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F. & Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14, 1555-1566 (2016).
- Rees, H. A. & Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat. Rev. Genet. 19, 770-788 (2018).
- Riesenberg, S. & Maricic, T. Targeting repair pathways with small molecules increases precise genome editing in pluripotent stem cells. Nat. Commun. 9, 2164 (2018).
- Savic, N. et al. Covalent linkage of the DNA repair template to the CRISPR-Cas9 nuclease enhances homology-directed repair. Elife 7, (2018).
- Wienert, B. et al. Timed inhibition of CDC7 increases CRISPR-Cas9 mediated templated repair. bioRxiv 500462 (2018). doi:10.1101/500462

유전자 편집으로 얻을 수 있는 가장 일반적인 결과는 하나의 allele은 SNP가 도입되고, 다른 allele은 indel이 도입되는 것으로, 하나의 allele에만 목적 서열이 편집되고 나머지 allele은 wild type을 가지는 clone을 얻는 것은 굉장히 어렵다. SNP/wild-type의 이형성을 가지는 clone을 효과적으로 얻기 위해, Paquet et al. (2016)에서 개발한 두 방법을 참고할 수 있다.

• 삽입 부위에서 10 nt 이상 먼 위치를 절단하는 sgRNA를 사용한다
• Wild type과 mutant 서열을 가지는 HDR template를 동일한 비율로 섞은 후 도입한다.

/ Reference
- Paquet, D. et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature 533, 125-129 (2016).