가이드라인

길이

약 24~25 mer가 적당하며, melting 온도 (Tm) 조정이 필요한 경우 21~28 mer 사이로 조절한다.

GC content

GC content (전체 primer 염기 수 중 G와 C 염기의 비중) 는 40~60% 로 한다.

3’ end

Primer의 길이가 짧을 경우, 3’ 말단은 4개의 G 또는 C 염기로 구성한다 (염기가 ‘clamping’ 효과를 제공함).

특히, cDNA나 gDNA를 증폭하는 universal primer의 경우, 이러한 염기 배치가 유용할 수 있다.

단, gene-specific primer는 이러한 염기의 추가로 비특이적인 priming 현상이 증가할 수 있다.

Tm

가능하다면 디자인된 primer의 melting 온도는 68~70℃로 맞춘다. 그렇지 않은 경우, ‘touchdown PCR’, ‘2 step-PCR’ 등을 통해 primer의 반응 특이성을 증가시킬 수 있다.

서열 특이성

Primer는 반드시 타겟 유전자에 특이적이어야 하며, 디자인전에BLAST 등을 통해 유사서열이 있는지 확인한다.  

PCR 증폭 수율은 PCR primer의 3’ hexamer에 의존적인 경우가 있고, primer 간에 강력하게 결합한다면 증폭효율이 낮아진다.

피해야 하는 조건

반복서열

Primer 서열 내에서 두 개 염기가 반복되는 패턴은 최대 4개까지만 가능 (e.g. ATATATAT)

반응 (runs)

하나의 염기 (3개 이상) 를 길게 배열하지 말 것.

Primer slippage로 mispriming 을 유발할 수 있다.

3’ 말단의 상보성

Forward primer와 reverse primer는 서로 결합하지 않아야 하고, 따라서 상보적인 G, C 구간이 (연속 4개 이상) 없어야 한다.

3’ 말단의 자기 상보성

(self-complementary)

자기 상보성 (self-complementary; e.g. forward primer 서열 내에)은 hairpin 구조를 형성할 수 있다. Stem 부분에 네 개의 G/C 염기와 loop 구조 내의 3개 염기만으로도 hairpin 구조가 형성될 수 있다.