PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase의 적용성 [제품정보 바로가기]
본 실험결과는 캘리포니아 대학(San Diego)의 Dr. Xuchu Que의 제공으로 작성되었습니다.

■ Introduction
Megaprimer-mediated domain swapping은 PCR을 사용하여 DNA 단편을 증폭하고, 이 단편을 두 번째 PCR의 megaprimer로 사용하여 clone를 제작하는 것이다. 두번째 PCR은 domain swapping과 전체 플라스미드 합성이 가능하도록 설계할 수 있다. 따라서 megaprimer PCR은 개별 clone 혹은 chimeric clone 시리즈를 구축하기 위해 사용하던 일반적인 제한효소 절단과 ligation을 이용하는 방법의 대안이 될 수 있다.

이 실험의 목적은 인간 B 세포로부터 저발현 항체 중쇄(heavy-chain) 가변 영역 유전자(IGHV4-59)를 증폭하고, 이를 domain swapping megaprimer PCR 기술을 사용하여 발현 벡터로 클로닝하는 것이다. 이 실험은 cDNA 인서트를 가지고 있는 더 큰 플라스미드 벡터를 재증폭하기 위해서 high-fidelity PCR polymerase가 필요하였다. 간단히 말하면, 인간 PBMC 세포의 total RNA를 역전사하여 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 주형으로 PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase를 이용하여 IGHV4-59 유전자 증폭하였다. 이 IGHV4-59를 더 큰 발현 벡터 (약 9kb)로 클로닝 하기 위하여, IGHV4-59를 megaprimer로 사용하고자 재증폭 후 정제하였다. 이 후 IGHV4-59를 domain swap quick-change PCR을 위해 발현 벡터 DNA와 혼합하였고, 최종 domain swap PCR은 PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase와 두 개의 중첩 (overlapping) primer를 사용하여 IGHV 유전자를 벡터에 삽입하도록 설계하였다.

■ Results
High-fidelity PCR 효소인 PrimeSTAR^®  GXL DNA Polymerase를 이용하였을 때 IGHV4-59 유전자가 대형 플라스미드 벡터에 성공적으로 삽입되었으며, 기존의 제한효소와 ligation을 이용한 클로닝 방법으로는 삽입되지 않았음을 DNA sequencing을 통해 확인하였다.


그림 1. (A) PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase 를 이용한 human IGHV gene 증폭 (B) Quality control sequencing을 위해 TOPO 벡터로 cloning한 결과


그림 2. DNA sequencing 결과는 PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase로 합성하여 클로닝한 산물이 인간 생식계열 V,D,J 유전자(human germline V, D, J gene)와 100% 일치함을 확인시켜 주었다. 돌연변이 또한 발견되지 않았다.


그림 3. IGHV4-59 유전자에 해당하는 DNA를 PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase로 증폭하고, pLiv7 벡터에 클로닝하였다. Domain-swap PCR은 대형 (약 9kb) 발현 벡터를 증폭하는 데 사용되었다.


그림 4. Sequencing chromatogram에서 domain-swap megaprimer PCR을 이용하여 발현 벡터에 클로닝된 삽입 유전자의 결합 영역 (joint region) 서열을 확인할 수 있다.

■ Conclusions
테스트 조건에서 PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase는 높은 정확도와 민감도로 cDNA에서 저발현 유전자를 증폭할 수 있었고, domain-swapped insert를 포함하는 큰 플라스미드 벡터 (약 10 kb)를 증폭하는 데에도 사용되었다. 반응 중 돌연변이는 발견되지 않아, PCR 증폭의 정확도도 확인되었다.

■ Methods
1. 역전사 반응
인간 PBMC B cell로부터 추출한 total RNA 1 µg을 이용하여 역전사 반응을 하였으며, 이 반응에는 RNA to cDNA EcoDry Premix(Takara)를 사용하였다

2. IGHV 증폭을 위한 PCR
반응 총액 50 ㎕로 PCR을 수행하였으며, 상세한 조성은 아래와 같다.

Components	Volume
5X PrimeSTAR® GXL Buffer	10 ㎕
2.5 mM dNTP	4 ㎕
Primer 1	1 ㎕
Primer 2	1 ㎕
cDNA	3 ㎕
ddH2O	30 ㎕
PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase	1 ㎕

PCR은 touchdown PCR로 수행하였으며, 반응 조건은 아래와 같다.

95°C, 3 min (hot start)
94°C, 20 sec	5 cycles
72°C 2 min
94°C 20 sec	30 cycles
68°C 20 sec
72°C 1 min
Hold at 10°C

증폭 후 산물을 플라스미드에 클로닝하여 시퀀싱으로 결과를 확인하였다(그림1,2).

3. Domain-swap PCR
Domain-swap PCR은 발현 벡터로 IGHV4-59 유전자를 넣기 위하여 벡터 DNA와 함께 수행하였다.
Megaprimer를 증폭하기 위한 반응 조성은 아래와 같다.

Component	Volume
5X PrimeSTAR® GXL Buffer	10 ㎕
2.5 mM dNTP	4 ㎕
Primer F	1 ㎕
Primer R	1 ㎕
IGHV4-59	1 ㎕
ddH2O	32 ㎕
PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase	1 ㎕

Megaprimer를 증폭하기 위한 PCR 조건은 아래와 같이 하였다.

95°C 20 sec	30 cycles
70°C 20 sec
72°C 20 sec

증폭한 DNA는 정제하여 megaprimer로 사용하였으며, domain-swap PCR의 반응 조성은 아래와 같이 하였다.

Component	Volume
5X PrimeSTAR® GXL Buffer	10 ㎕
2.5 mM dNTP	4 ㎕
Vector DNA	1 ㎕ (50 ng)
Megaprimer	4 ㎕ (350 ng)
ddH2O	30 ㎕
PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase	1 ㎕

PCR은 touchdown PCR로 수행하였으며, 반응 조건은 아래와 같다.

95°C, 3 min (hot start)
94°C, 20 sec	5 cycles
72°C 5 min
94°C 15 sec	25 cycles
68°C 15 sec
72°C 2 min
72°C 15 min

4. E.coli 형질전환
Dpn I (1㎕)을 이용하여 주형을 절단하고, PCR 산물5 ㎕를 XL10-Gold E. coli competent cells에 형질전환하였다. 재조합 플라스미드는 정제후 시퀀싱하여 결과를 확인하였다 (그림 3,4).