Terra PCR Direct Polymerase를 이용하여 GC-rich target과 크기가 큰 target (4 kb)의 direct amplification시 타사의 다른 효소보다 뛰어난 성능을 가지고 있음을 확인하였다.

Overview : Terra PCR Direct Polymerase Mix는 최적화된 DNA polymerase를 포함하고 있다.
타사 PCR 효소와의 비교: Terra PCR Direct Polymerase는 GC-rich target 증폭에 탁월한 능력을 가지고 있음을 확인하였다.

■ Introduction
Terra PCR Direct Polymerase Mix는 DNA 정제 없이 조직이나 crude extracts에서 직접 증폭이 가능하도록 최적화된 DNA polymerase를 포함하고 있다. 본 효소는 최대 4kb까지 증폭 가능하며, 또한 증폭이 까다로운 주형 (예시 - GC 함량 70% 이상) 역시 증폭할 수 있다. 이 효소는 PCR 억제제 (inhibitor), growth serum 및 그 외 template와 같이 혼입될 수 있는 물질이 있는 상태에서도 DNA 증폭이 가능하기 때문이다.

■ Results
타사 PCR 효소와의 비교
Terra PCR Direct Polymerase Mix는 사람 손톱 DNA가 포함된 crude extract에서 GC-rich target과 약 4kb까지의 target을 타사의 효소보다 뛰어나게 증폭함을 확인하였다.

Terra PCR Direct Polymerase Mix (Panel A)는 모든 샘플에서 성공적으로 목적 유전자를 합성하였다. A사의 효소 (Panel B)는 AT-rich sample (Lane 4)에서 희미한 목적 band를 확인하였으나, 나머지 샘플에서는 모두 증폭하지 못하였다. B사 효소 (Panel C)는 GC-rich target (Lane 3, 6)은 증폭하지 못하였고, target size가 길어질수록 증폭 효율이 감소하였다 (Lanes 2, 5, 8).

[그림] 사람 손톱 DNA가 포함된 crude extract에서 3개의 DNA polymerase를 이용하여 다양한 크기와 다양한 GC content의 목적유전자를 증폭하여 그 결과를 agarose gel 전기영동으로 비교하였다. Terra PCR Direct Polymerase Mix는 GC-rich template는 물론 최대 4kb 길이의 목적 유전자까지 증폭할 수 있는 반면 (Panel A), A사 효소는 AT-rich sample 하나를 제외하고 증폭 효율이 매우 낮거나 전혀 증폭되지 않았다  (Panel B). B사 효소를 사용한 경우는 GC content 50% 이상에서는 증폭이 되지 않았다 (Panel C) (Lane M: pHY marker).

Amplification results for Terra Direct compared to two other DNA polymerases
Lane No.	Target gene	Amplicon size	% GC content	증폭결과
				Terra PCR Direct	A사 효소	B사 효소
1	UCRchr9*	1.1 kb	26%	+	–	+
2	EGFR	1.0 kb	50%	+	–	+
3	TGFβ1	1.0 kb	72%	+	–	–
4	UCRchr11**	2.2 kb	27%	+	+	+
5	IGF2R	2.0 kb	50%	+	–	+
6	IGFβ1	2.0 kb	69%	+	–	–
7	FragileX	4.0 kb	33%	+	–	+
8	EGFR	3.8 kb	44%	+	–	–
9	TGFß1	4.0 kb	63%	+	–	–

*UCRchr9 = Chromosome 9 AT-rich noncoding region.
**UCRchr11 = Chromosome 11 AT-rich noncoding region

■ Conclusions
이 실험은 Terra PCR Direct Polymerase가 법의학 분석에 자주 사용되는 사람의 손톱과 같이 매우 단단하고, 용해하기 어려운 조직을 분석하는 데 좋은 선택임을 보여주었다. Terra PCR Direct Polymerase는 GC-rich template에서 최대 4 kb까지 증폭할 수 있었다. 반면, B사 Polymerase는 GC content 50% 이상인 경우 유전자를 증폭하지 못하였으며, A사 Polymerase는 AT-rich 샘플 1개를 제외하고는 증폭효율이 매우 낮거나 전혀 증폭하지 못하였다.

■ Methods
5 mg 사람 손톱 샘플을 44 ㎕ SimplePrep™ reagent for DNA (한국판매불가)에 넣어, SimplePrep™ reagent for DNA의 매뉴얼에 따라 사람 손톱 DNA를 포함하는 crude extract를 제작하였다. 제작한 crude extract를 2.5 ㎕씩 분주하여, PCR 반응액 25 ㎕ 기준으로 다양한 유전자 증폭을 확인하였다. 각 효소의 반응 조건은 각 제조사에서 추천하는 조건대로 이용하였으며, 증폭 후 3 ㎕를 agarose gel에 전기영동하여 결과를 확인하였다.

[Terra PCR Direct Polymerase Mix의 PCR 반응조건]

98°C 2 min
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