메틸화 연구를 위한 bisulfite 처리된 DNA의 탁월한 증폭

EpiTaq hot-start DNA polymerase

• 광범위한 타겟 사이즈에 대한 고효율 증폭
• MgCl₂ 별도 제공 : 반응 조건 검토에 최적

■ Introduction
DNA의 아세틸화 및 메틸화와 같은 후생유전학적 현상은 염색질 (chromain)의 구조를 변화시켜 각각의 유전자가 전사되거나 전사되지 못하게 한다. 메틸화 연구에서는 특정 CpG 영역의 메틸화 패턴을 분석하기 위해 종종DNA에 bisulfite를 처리한다. 그러나 bisulfite가 처리된 DNA에는 uracil이 존재하는 등 다양한 요인에 인해 기존의 polymerase로는 증폭에 어려움이 있었다. Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA)/Bisulfite sequencing을 위한 PCR용 효소인 TaKaRa EpiTaq HS (for bisulfite-treated DNA) (Code R110A)는 CpG의 메틸화 분석과 AT나 GC 함량이 높은 주형의 증폭에 적합한 hot start PCR 효소이다. 이 효소는 고온에서 denaturation 되기 전까지 효소 활성을 억제하는 anti-Taq 항체와 결합하여 mispriming이나 primer-dimer 형성으로 인한 비특이적 증폭을 억제한다. EpiTaq HS DNA polymerase은 마그네슘 (Mg²⁺)과 dNTP 농도를 조정하여 증폭 효율, 반응 특이성을 조절할 수 있기 때문에 다양한 크기의 DNA 증폭이 가능하며, 지금까지 증폭이 어려웠던 타겟에도 증폭할 수 있었다.


■ Results
PCR 증폭 전 DNA의 Bisulfite 처리
C-5 위치의 cytosine 메틸화는 mammalian에서 특이적으로 나타나는 후생유전학적인 현상이다. Bisulfite 처리하여 DNA 메틸화를 분석하는 방법은 널리 사용되는 효과적이고 편리한 방법이다 (그림 1).
DNA에 Sodium bisulfite를 처리하면 C-6에서 메틸화가 되지 않은 cytosine은 5,6-dihydrouracil-6-sulfonate로 탈아미노화되고, 알칼리성 용액을 첨가하면 sulfonate 그룹이 제거되면서 cytosine이 uracil로 전환되어, 분석 시 thymine으로 읽힌다. 반면 메틸화된 cytosine은 그대로 남아 있게 된다.

그림 1. Bisulfite 처리를 통해 메틸화되지 않은 cytosine은 uracil로 전환되는 반면 메틸화되 있었던 cytosine은 그대로 유지된다.
EpiTaq HS DNA polymerase는 uracil이 포함된 주형을 높은 효율로 증폭한다. 이 효소는 uracil을 thymine으로 바꾸고, 메틸화된 cytosine을 메틸화가 되지 않은 cytosine으로 바꾼다. 따라서 PCR 산물에 남아 있는 모든 cytosine은 기존에 메틸화 되어 있었던 cytosine이라고 볼 수 있다. Bisulfite가 처리된 DNA는 조각이 나고 단일 가닥으로 변성되어 기존의 중합효소로는 증폭하기 어려웠다. 또한 bisulfite로 처리된 DNA의 높은 AT 함량으로 인해 비특이적 증폭이 흔하게 발생되었다. EpiTaq HS DNA polymerase는 이러한 uracil을 포함하고 AT가 풍부한 DNA의 증폭에 최적화되어 있다. 또한 처음 denaturation 단계까지 hot-start 효소를 비활성화하는 anti-Taq 항체를 포함하여 primer dimerization 및 mispriming으로 인한 비특이적 증폭 산물을 최소화한다.

하기 데이터는 uracil을 포함하면서 편향된 염기쌍 구성을 가진 손상된 DNA를 증폭하는데 다소 어려웠던 다른 효소들과 달리 EpiTaq HS DNA polymerase가 월등하게 높은 증폭 효율을 보이는 것을 하기 데이터에서 확인할 수 있었다.

다양한 타겟 크기에 대한 높은 증폭 효율
Bisulfite가 처리된 DNA의 메틸화 분석에 성공을 방해하는 가장 큰 어려움은 BRCA1 (1,017 bp)과 같은 긴 타겟의 증폭이다. 다른 중합효소 역시 짧은 타겟은 쉽게 증폭했지만, 긴 타겟은 대부분 증폭이 되지 않았다. 반면 EpiTaq HS DNA polymerase가 짧은 타겟 (~150 bp)과 긴 타겟 (~1,000 bp)을 증폭할 때 모두 높은 성공율을 보였다 (그림 2). EpiTaq HS DNA polymerase와 다른 다카라의 중합효소를 포함하여 총 여섯 개의 중합효소를  비교하였을 때, 긴 타겟 (BRCA1)과 짧은 타겟 (CDKN2A)을 증폭할 때 모두 EpiTaq DNA polymerase는 다른 중합효소보다 성능이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다 (그림 3).

그림 2. EpiTaq HS DNA polymerase는 다양한 타겟 사이즈에 대해 높은 증폭 효율 실현
153 bp에서 1,017 bp 까지의 모든 타겟은 다음과 같은 PCR 반응 조건을 사용하여 EpiTaq HS DNA polymerase로 증폭하였다.

• PCR 반응 조건 (40 cycle).
  - 98°C 10초
  - 55°C 30초
  - 72°C 30초 (또는 613 bp와 1,017 bp 샘플은 1분 소요)

그림 3. EpiTaq HS DNA polymerase와 다섯 가지 다른 중합효소 간의 증폭 효율 비교.
Lane 1-7번은 제조사의 권장 프로토콜에 따랐다. EpiTaq HS DNA polymerase는 긴 타겟인 BRCA1에서 다른 효소에 비해 훨씬 우수한 수율을 보였다.


마그네슘 (Mg²⁺) 농도 조정을 통한 반응 최적화
마그네슘은 DNA 중합효소의 보조인자이며, 증폭 효율을 극대화하기 위해서는 마그네슘의 농도 조절이 중요하다. 마그네슘 농도를 낮추면 특이성이 증가하고 마그네슘 농도를 높이면 증폭 효율과 신장성이 향상된다. TaKaRa EpiTaq HS (for bisulfite-treated DNA)에는 PCR에 필요한 EpiTaq 효소, Mg²⁺ free buffer, MgCl₂ 용액, dNTP mixture 시약이 모두 포함되어 있으며, PCR 반응을 최적화할 수 있도록 시약들이 별도로 포장되어 있다. 그림 4는 Mg²⁺ 농도 조정의 중요성을 보여주며, CDKN2A의 증폭 효율은 2.5mM Mg²⁺에서 가장 높고, MLH1의 증폭 효율은 타겟 길이에 관계없이 3.0 mM Mg²⁺에서 가장 높았다.


그림 4. MethylEasy Xceed Rapid DNA Bisulfite Modification Kit (종매)를 사용하여 HeLa genomic DNA의 Bisulfite 처리를 수행
CDKN2A 또는 MLH1의 upstream CpG 부분을 타겟하며 증폭 크기는 316 bp (CDKN2A), 607 bp (MLH1) 및 877 bp (MLH1) 였다.

■ Conclusions
Uracil을 포함한 bisulfite 처리된 DNA의 증폭을 방해하는 몇 가지 요인이 있다. Bisulfite 처리로 인해 이중 가닥 DNA는 단일 가닥으로 변성되고, 긴 타겟일수록 증폭이 어렵다.   

Hot-start 기술이 포함된 EpiTaq HS DNA polymerase는 구성 시약으로 PCR 반응을 최적화할 수 있으며, 다양한 길이의 타겟을 높은 효율로 증폭할 수 있다. 따라서 다른 PCR 효소가 길이가 긴 타겟을 안정적으로 증폭하지 못하는 경우, EpiTaq HS DNA polymerase를 사용하면 실험 시간을 단축할 수 있다.

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