Multiplex PCR with Titanium Taq DNA Polymerase
Data provided by Aaron Abbott, Helen Butler, Ph.D., Nicola Redhead, and Jiannis Ragoussis, Ph.D.
Genomics Laboratory, Wellcome Trust Centre for Human Genetics

■ Introduction
Sequenom사의 MassARRAY System을 이용하여 세 가지 다른 브랜드의 Taq polymerase 성능을 두개의 MALDI-TOF single nucleotide polymorphism (SNP) 분석결과로 비교하였다. Titanium^® Taq DNA polymerase는 이러한 high throughput 분석에서 다른 두 제품보다 높은 성능을 보여 일반적인 PCR은 물론 특정 목적의 PCR 분석에도 적합한 것을 확인하였다.

Titanium^® Taq DNA polymerase는 넓은 범위의 MgCl₂ 농도에 적용할 수 있고, 포유류 genomic DNA와 같이 매우 복잡한 구조의 타겟도 최대 2 kb까지 증폭할 수 있으며, hot start 기술을 이용하여 샘플의 증폭, copy 수가 낮거나 드물게 존재하는 타겟의 증폭에도 적합하다. 제품은 효소 및 buffer로 구성된 기본 제품 외에도 상온보관이 가능한 동결건조 분주 형태의 High Yield PCR EcoDry Premix 도 판매되고 있다.

보다 정확하고 빠른 결과를 얻을 수 있는 Titanium Taq DNA Polymerase의 사용 사례를 소개하고자 한다..

■ Results
효소를 기반으로 한 whole-genome SNP genotyping
다수의 개인으로부터 다수의 SNP를 검출하고 특성화 (유전자형 분석) 할 수 있는 기술을 통해 복잡한 장애의 원인이 되는 유전자 변이를 식별할 수 있다. 전체 genome의 SNP genotyping을 위한 high-throughput 접근 방식은 Sequenom사에서 개발한 플랫폼을 사용하는 mass spectroscopy가 있다. 정확도가 매우 높은 이 방법은 대립유전자 특이적인 primer를 사용하여 primer extension 반응을 진행하고 생성 산물을 MassARRAY 시스템을 사용한 matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectroscopy로 비교한다 (Jurinke외 2012).
96개 또는 384개의 샘플을 병렬로 증폭 및 분석함으로써 많은 샘플에서 여러 대립 유전자를 동시에 검사할 수 있다.

Titanium Taq DNA Polymerase는 multiplex PCR을 포함한 많은 분야에 이상적이고 신뢰할 수 있는 고감도의 효소로 다음의 실험에서 Titanium Taq DNA Polymerase는 최고 품질의 SNP (전체 pass rate 및 80% pass rate 임계값을 초과하는 SNP 수로 측정)를 생성하고, 다양한 MgCl₂ 농도에서 우수한 성능을 나타낸다. Multiplex PCR을 이용한 SNP genotyping에서 Titanium Taq DNA Polymerase는 함께 테스트한 타사 제품 대비 더 높은 품질의 증폭된 SNP를 정확하게 생성한다.  

신뢰도 높은 결과를 얻기 위한 최적화 과정 최소화
Multiplex PCR 반응산물의 품질을 극대화시키기 위해서는 아래의 몇 가지 요인을 최적화하는 것이 필요하다.

• PCR 효소의 정확도
• MgCl₂의 농도
• PCR 효소의 농도

이러한 요소는 단일 염기쌍의 변화를 안정적으로 감지하는 데 특히 중요한데, Titanium Taq을 사용하면 이러한 최적화 과정을 생략할 수 있어 전체 실험 시간을 줄일 수 있다. 본 실험을 통해 Titanium Taq이 정확한 데이터 (높은 SNP pass rate)을 제공하고 다양한 MgCl₂ 농도에 견딜 수 있음을 확인하였다. Titanium Taq DNA Polymerase의 성능 테스트를 위해 multiplex PCR 반응에 기반한 세 가지 분석이 진행되었다: 9-plex PCR, Sequenom사의 SpectroDESIGNER software로 디자인 한 6-plex PCR, 수동으로 설계한 6-plex PCR (그림 1 및 표 1).

먼저, Titanium Taq DNA Polymerase의 성능을 세 가지 MgCl₂ 농도 (2.5 mM, 3.5 mM, 5.0 mM)에서 평가하고, 권장하는 2.5 mM 농도에서 9-plex PCR 반응으로 세 회사의 PCR 효소를 비교평가 하였다 (그림 1 및 표 1). 한 실험에서 576개의 genotype을 평가하였고 전체 pass rate은 표 1에 기재하였다.


그림 1. 9-plex PCR 반응에서 Titanium Taq DNA Polymerase를 사용하여 얻은 결과 (16번 염색체에 위치한 9개의 SNP)
각 SNP에서 생성된 증폭산물의 피크는 색상으로 구분하였고, primer와 2개의 예상 대립 유전자 및 중단되었을 가능성이 있는 피크를 포함한다. 피크는 고품질로, 5,00~8,500 dalton 범위를 커버한다.

표 I : 9-plex PCR 결과
DNA Polymerase	MgCl2 concentration	Overall pass rate	SNPs with <80% pass rate
Titanium Taq	2.5 mM	89.58	0
Titanium Taq	3.5 mM	90.74	0
Titanium Taq	5.0 mM	85.76	3
Polymerase 1	2.5 mM	86.00	1
Polymerase 2	2.5 mM	68.29	4

표 2 : MgCl2 농도 2.5 mM, 3.5 mM에서의 9-plex PCR 결과
DNA Polymerase	MgCl2 concentration	Overall pass rate	SNPs with <80% pass rate
Titanium Taq	3.5 mM	95.80	0
High-concentration Polymerase 2	2.5 mM	84.00	2
Polymerase 1	2.5 mM	85.76	2
Polymerase 2	3.5 mM	86.57	2

표 1과 표 2의 맨 오른쪽 열은 본 실험에서 사용된 품질 임계값 (quality threshold) 80% 미만의 pass rate을 가진 SNP의 수를 나타낸다. 표 1에서 Titanium Taq DNA Polymerase는 3.5 mM MgCl₂에서 전체 pass rate이 가장 높았고, 2.5 mM MgCl₂ 농도의 Titanium 효소가 두번째로 높았다. 표 2는 그림 1에서 보여준 동일한 9-plex 반응을 두번째로 진행했을 때의 실험결과를 나타내고 있다. 본 실험에서는 3.5 mM MgCl₂의 Titanium Taq DNA Polymerase (표 1에서 가장 좋은 성능)와 2.5 mM MgCl₂ 농도의 PCR polymerase 1 제품, 그리고 두 가지 다른 농도의 PCR polymerase 2 (하나는 3.5 mM MgCl₂의 일반 농도 polymerase이고, 다른 하나는 2.5 mM MgCl₂가 포함된 고농도의 polymerase임)를 비교하였다. 500~800번의 개별 반응을 진행 후 확인한 결과, Titanium Taq DNA Polymerase의 우세한 성능차이가 MgCl₂ 및 효소의 농도와 관계없이 유지되며, 다시 한번 Titanium Taq DNA Polymerase가 3.5 mM MgCl₂에서 95.8%의 가장 높은 pass rate을 보인 반면, PCR polymerase 2의 최고 pass rate은 3.5 mM MgCl2에서 86.57%였다. PCR 효소 2의 성능은 효소를 34% 추가 사용해도 결과가 개선되지 않았다.

까다로운 분석에서도 일관된 성능 유지
2개의 서로 다른 6-plex 반응 (표 3)으로 Titanium Taq DNA Polymerase와 PCR polymerase 2를 비교하였다: 하나는 수작업으로 디자인하였고 (반응 1), 다른 하나는 Sequenom사의 SpectroDESIGNER 소프트웨어를 사용하여 디자인하였다 (반응 2). 12개의 상이한 SNP를 분석하고, 96개 DNA 샘플을 테스트하여 양성 유전자형의 수가 결정되었다 (통과/96). Titanium Taq DNA Polymerase와 PCR polymerase 2의 차이는 컸고, 많은 개별 SNP 분석에서 실패한 PCR polymerase 2와는 달리 Titanium Taq DNA Polymerase는 지속적으로 우수한 결과를 나타내었다.

표 3 : 6-plex PCR을 이용한 PCR 효소 평가 결과
SNP ID No.	Titanium Taq DNA Polymerase		Polymerase 2
Reaction 1	Pass/96	% pass	Pass/96	% pass
1	90	93.75	0	0.00
2	51	53.13	0	0.00
3	80	83.33	1	1.04
4	78	81.25	0	0.00
5	76	79.17	0	0.00
6	82	85.42	0	0.00
Reaction 2
26	93	96.88	4	4.17
30	94	97.92	2	2.08
31	87	90.63	74	77.08
33	91	94.79	65	67.71
40	91	94.79	0	0.00
50	89	92.71	0	0.00

■ Conclusions
SNP genotyping을 위한 high-throughput multiplex PCR 분석에서 Titanium Taq DNA Polymerase는 테스트 한 다른 PCR 효소보다 지속적으로 더 나은 성능을 보이며 가장 신뢰할 수 있는 PCR 효소라는 것을 확인하였다. 향상된 수율 및 증폭 특이성 외에도 연구자들은 10~15분의 효소 활성화 시간을 필요로 하는 타사 제품에 비해 Titanium Taq DNA Polymerase는 1~2분의 활성화 시간으로 PCR 시간 단축에 적합하다고 이야기하였다. 전체적으로 이것은 샘플 실험량이 많은 연구분야에 중요한 고려사항 중 하나인 PCR 시간을 14분이나 단축하는 결과로 이어진다.
Titanium Taq DNA Polymerase를 사용하면 높은 신뢰도와 고감도로 빠르고 강력하게 multiplex PCR을 진행할 수 있다.

■ Methods
PCR 반응은 348-well plate에 반응 당 총 5 ㎕ 볼륨으로 진행하였다, PCR 반응액에는 2.5 ng DNA, 각 제조사의 반응 버퍼, dNTP 200 μM, PCR 효소 0.1 U (사용된 모든 PCR 효소는 5 U/㎕ 농도에서 0.02 ㎕ 사용), primer 200 nM, 각 표에 표시된 농도의 MgCl₂가 포함되었다. 표 2의 실험 중 ‘고농도의 PCR polymerase 2’ 조건은 PCR polymerase 2를 3.9 ㎕ 추가해서 사용하였다.
Titanium Taq DNA Polymerase의 PCR 조건은 95℃로 가열 후, 94℃ 20초, 56℃ 30초, 72℃ 1분을 45 cycle 반응 후,마지막 단계를 72℃ 3분간 반응하였다. 첫 열 활성화 단계는 PCR polymerase 1은 15분, PCR polymerase 2는 10분으로 설정하였고, 그 외 PCR 조건은 동일하게 수행하였다.

■ Reference
Jurinke, C., et al. Methods Mol. Biol. 187, 179–192 (2002).

본 연구에 사용된 고감도 PCR 효소 TITANIUM® Taq DNA Polymerase 확인하기