• 10 pg의 소량 샘플에 적용 가능한 preamplification
• 편향성이 가장 낮은 preamplification mix (타사 제품의 2~3배 이상 낮음)
• FFPE 조직 샘플에서 162개의 유방암 관련 유전자의 우수한 preamplification 확인

■ Introduction
Real Time PCR (qPCR), SNP genotyping, target enrichment는 광범위한 연구 및 임상 분야에서 매우 유용한 분자생물학 기술이다. 그러나 이러한 기술은 FFPE 조직, 소량 샘플, 저농도 biofluid 샘플 등에서 추출된 핵산에서는 적용이 제한될 수 있다.

Preamplification (또는 booster PCR)을 통해 cDNA 또는 gDNA를 편향성없이 target-specific하게 증폭하여 이러한 한계를 극복할 수 있다. Preamplification에서는 높은 민감도를 가지고 편향성 없이 소량의 주형 DNA를 증폭할 수 있는 Preamplification Mix를 사용하는 것이 중요하다. 특정 타겟에서 PCR 효율이 낮은 경우 발생하는 PCR의 편향성은 preamplification 된 샘플 중 특정 타겟의 발현을 왜곡하고, 그 결과 preamplification 이후의 실험 결과에 영향을 미친다.

Prelude PreAmp Master Mix (Code 638541)는 최적의 효소와 버퍼로 preamplification시에 모든 target에서 PCR 효율을 극대화한다. 이 제품은 10 pg cDNA 혹은 gDNA의 극소량 샘플에서 편향성 없이 100개 이상의 타겟을 preamplification 할 수 있다.

■ Results
Get the benefits of preamplification while maintaining uniform representation
일반적인 qPCR로는 측정이 불가능한 소량의 샘플도 preamplification을 진행하면 유전자 발현을 분석할 수 있다 (그림 1). 이 실험에서는 human Universal QUICK-Clone II cDNA (Code 637260)를 cell cycle과 관련된 88개의 유전자와 8개의 house keeping 유전자를 타겟으로 하는 PrimerArray Cell Cycle (Human) panel (종매)로 측정하였다. 100 pg의 cDNA (보라색)와 Prelude PreAmp Master Mix로 10 cycle을 preamplification한 cDNA (파란색)를 비교한 결과 preamplification을 진행하지 않은 cDNA는 96개 유전자 중 일부만이 검출된 반면 (Ct 값 32이하 기준), preamplification을 진행한 cDNA는 96개의 유전자 모두가 Ct 값 17에서 30 사이로 검출되었다 (그림 1. 파란색).


그림 1. PreludePreAmp Master Mix을 사용해 preamplification한 샘플과 하지 않은 샘플의 검출 비교.
위의 그래프는 PrimerArray Cell Cycle (Human) panel에 있는 96개의 타겟을 모두 테스트하였으나 데이터의 식별이 가능하도록 일부 타겟만 X축에 표기하였다. 또한 32 이상의 Ct 값을 가진 타겟은 표에서 제외하였다. 전체 타겟 유전자에 대한 데이터는 이 링크에서 확인할 수 있다.

Preamplification에서 감도만큼 중요한 요소는 편향성 없는 증폭이다. Preamplification 후 결과가 특정 primer에 의한 PCR 편향성으로 인한 결과인지 또는 유전자가 단순히 처음 샘플에서 높게 발현된 것인지 확인하기 위해 아래의 실험을 진행하였다. 이 실험에서는 Prelude PreAmp Master Mix (파란색)로 10 cycle preamplification한 cDNA 100 pg을 동일한 샘플의 preamplification 되지 않은 20 ng의 cDNA (보라색)와 비교하였다 (그림 2). 그 결과 모든 96개의 유전자에서 Ct 값이 매우 유사하게 일관된 결과가 나왔다. 따라서 Prelude PreAmp Master Mix를 사용해 10 cylce의 preamplification을 진행하면 100 pg의 cDNA도 편향성 없이 qPCR 분석이 가능하다.


그림 2. PreludePreAmp Master Mix을 사용한 편향성 없는 preamplification 확인.
위의 그래프는 PrimerArray Cell Cycle (Human) panel에 있는 96개의 타겟을 모두 테스트하였으나 데이터의 식별이 가능하도록 일부 타겟만 X축에 표기하였다. 전체 타겟 유전자에 대한 데이터는 이 링크에서 확인할 수 있다.

샘플의 양이 매우 적거나, 유전자 발현량이 낮은 경우, 10 cycle 대신 14 cycle의 preamplification이 필요할 수 있다. 일반적으로 cycle이 늘어나면 preamplification에서 편향성이 생길 가능성이 높아지는데, 이를 테스트하기 위해 100 pg의 cDNA를 Prelude PreAmp MasterMix로 10 cycle (파란색), 14 cycle (보라색)을 preamplification하고 이전과 동일한 방법으로 qPCR을 진행하였다. 그 결과 cycle수를 14로 늘려도 편향성 없이 균일하게 증폭되는 것을 확인할 수 있었다 (그림 3). Preude PreAmp MasterMix를 사용하면 이러한 편향성에 대한 걱정 없이 더 높은 cycle의 증폭이 가능하다.


그림 3. PreludePreAmp Master Mix을 사용한 10 cycle과 14 cycle에서 모두 일정한 preamplification 확인.
위의 그래프는 PrimerArray Cell Cycle (Human) panel에 있는 96개의 타겟을 모두 테스트하였으나 데이터의 식별이 가능하도록 일부 타겟만 X축에 표기하였다. 전체 타겟 유전자에 대한 데이터는 이 링크에서 확인할 수 있다.

편향성에 대한 성능을 더욱 확인하기 위해 10 cycle 및 14 cycle로 진행된 preamplification 샘플의 ΔΔCt 값을 분석하였다. 본 분석법에서 ΔΔCt 값이 ±0.75 미만의 차이를 보이는 경우를 편향성 없는 증폭이라고 했을 때 96개의 유전자 모두 이러한 기준을 만족했으며 (그림 4), Prelude PreAmp Master Mix는 최대 14 cycle의 Preamplification을 진행하는 경우에도 편향성 없이 100pg의 cDNA로 높은 preamplification 효율을 보이는 것을 확인하였다.


그림 4, PreludePreAmp Master Mix을 사용한 10 cycle과 14 cycle의 preamplification의 ΔΔCt 분석 결과.
위의 그래프는 PrimerArray Cell Cycle (Human) panel에 있는 96개의 타겟을 모두 테스트하였으나 데이터의 식별이 가능하도록 일부 타겟만 x축에 표기하였다. 전체 타겟 유전자에 대한 데이터는 이 링크에서 확인할 수 있다.

Preamplification with less than 100 pg of starting material
시판되는 다른 preamplification mix는 1 ng 이하의 샘플 증폭이 불가능한 반면, Prelude PreAmp Master Mix는 100 pg의 cDNA에 대해 편향성 없이 14 cycle의 preamplification이 가능하다. 예를 들어, FFPE 조직, 액체 생검 또는 cell free DNA나 circulating DNA 같이 제한된 샘플에 Prelude PreAmp Master Mix를 사용하면 100 pg 이하의 샘플도 preamplification을 적용할 수 있다. 이를 테스트하기 위해 12.5 pg, 50 pg, 또는 100 pg의 cDNA를 Prelude PreAmp Master Mix로 14 cycle을 preamplification하였다. 이후 이전과 동일한 방법으로 분석한 결과 처음 샘플의 투입량과 관계없이 모든 유전자가 편향성 없이 균일한 결과를 보였다 (그림 5). 따라서 Prelude PreAmp Master Mix는 최소 12.5 pg의 시작물질로도 타겟을 측정할 수 있으므로 타의 추종을 불허하는 감도의 검출이 가능하다.



그림 5. 12.5 pg 까지 소량 샘플의 PreludePreAmp Master Mix을 사용한 편향성 없는 고감도 preamplification 확인.
위의 그래프는 PrimerArray Cell Cycle (Human) panel에 있는 96개의 타겟을 모두 테스트하였으나 데이터의 식별이 가능하도록 일부 타겟만 x축에 표기하였다. 전체 타겟 유전자에 대한 데이터는 이 링크에서 확인할 수 있다.

Unrivaled performance when compared to other preamplification mixes
Preamplification을 하고자 하는 경우 Prelude PreAmp Master Mix을 사용하면 타사 multiple master mix 대비 가장 낮은 편향성으로 가장 높은 효율의 preamplification이 가능하다. 타사의 preamplification mix 제품과 Prelude PreAmp Master Mix를 비교하기 위해 (그림 6) PreAmp Master Mix (TBU)와 타사 master mix (TaqMan PreAmp Master Mix (ABI), SsoAdvanced PreAmp Supermix (BioRad), PerfeCTa PreAmp SuperMix (Quanta))를 사용해 10 pg의 cDNA를 10 또는 14 cycle로 각 제조사의 protocol에 따라 preamplification 하였다. 이후 GAPDH로 보정하여 ΔΔCt 값을 계산하였다. 이후 ±0.75의 threshold가 amplification의 편향성 기준으로 사용하였다 (표 I). 그 결과 Prelude PreAmp Master Mix가 가장 뛰어난 성능으로 96개의 타겟 중 92개 (96%)가 편향성 없는 증폭을 (±0.75 이내)을 보였다. 반면 타사 제품의 경우 전체의 75% 타겟만이 편향성 없는 증폭을 보였다. 따라서 Prelude PreAmp Master Mix가 소량 샘플의 편향성 없는 preamplification에 가장 뛰어나다는 것을 확인할 수 있었다.



그림 6. Prelude PreAmp Master Mix을 사용한 타사 대비 편향성 없는 preamplification 확인.
위의 그래프는 PrimerArray Cell Cycle (Human) panel에 있는 96개의 타겟을 모두 테스트하였으나 데이터의 식별이 가능하도록 일부 타겟만 x축에 표기하였다. 전체 타겟 유전자에 대한 데이터는 이 링크에서 확인할 수 있다.

Product	No. assays within ±0.75	Percent bias
Prelude PreAmp Master Mix	92 / 96	4%
TaqMan PreAmp Master Mix	87 / 96	9%
SsoAdvanced PreAmp Supermix	72 / 96	25%
PerfeCTa PreAmp SuperMix	73 / 96	24%

표 I. Prelude PreAmp Master Mix의 타사 대비 편향성 없는 preamplification

Superior preamplification of 162 breast cancer-related genes in FFPE tissue
FFPE 조직 샘플에서 162개의 유방암 관련 타겟으로 Prelude PreAmp Master Mix을 테스트했다. 먼저 FFPE 조직에 RNA는 NucleoSpin total RNA FFPE로 추출했고, PreimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) (Code RR036)으로 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 Prelude PreAmp MasterMix로 14 cycle preamplification한 후에 custom한 162개의 유방암 panel로 타겟 유전자를 SmartChip TB Green gene expression Master Mix (Code 640211)과  SmartChip Real-Time PCR System (Code 640022)을 사용해 테스트하였다. 이후 panel의 모든 결과를 6개의 house keeping gene의 중앙값으로 보정하여 ΔΔCt 값을 계산하였다 (그림 7). 이때, ±1.5의 threshold가 amplification 과정에서 실험 효율 및 샘플의 quality 차이에 의한 편향성 여부의 기준으로 사용되었다. 그 결과 FFPE 같은 PCR이 어려운 샘플에서 다수의 타겟을 preamplification할 때에도 97%의 타겟 (152 / 162)을 편향성 없이 검출할 수 있었다.



그림 7. FFPE 조직에서 162개의 유방암 표적을 분석할 때 Prelude PreAmp Master Mix를 사용하면 매우 편향성이 적은 preamplification이 가능하다.

제조사의 매뉴얼에 따라 TaqMan PreAmp Master Mix를 사용해 유사한 실험을 진행한 후 위와 같이 6개의 house keeping gene의 중앙값으로 보정하여 ΔΔCt을 계산했다 (그림 8). 그 결과를 Ct값 ±1.5를 threshold로 사용하여 샘플들 간의 PCR의 효율 차이 및 quality 차이에 의한 편향성 여부를 판정하였다. 테스트 결과 이 master mix 제품이 preamplification에서 편향성이 컸으며, 오직 91%의 타겟을 ±1.5의 threshold의 범위 안에서 검출할 수 있었다. 따라서 TaqMan PreAmp Master Mix보다 Prelude PreAmp Master Mix가 편향성이 적어 (1/3) preamplification에 더욱 유리하다고 볼 수 있다 (표 II).



그림 8. FFPE 조직에서 162개의 유방암 표적을 분석할 때 타사 대비 편향성이 적은 Prelude PreAmp Master Mix가 TaqMan PreAmp Master Mix 보다 더 편향성이 적다.

Product	No. assays within ±1.5	Percent bias
Prelude PreAmp Master Mix	157 / 162	3%
TaqMan PreAmp Master Mix	142 / 162	9%

표 II. Prelude PreAmp Master Mix의 TaqMan PreAmp Master Mix 대비 편향성 없는 preamplification

■ Coclusion
연구실에서 양이 제한되고 구하기가 어려운 종류의 샘플을 사용하는 경우가 늘어남에 따라 preamplification은 qPCR, SNP genotyping, target enrichment 분석 등을 매우 높은 민감도로 편향성 없이 진행할 수 있는 강력한 기술이 되었다. 그러나 preamplification으로 최고의 결과를 얻기 위해서는 극소량의 샘플 (<100 pg)을 측정할 수 있는 감도와 편향성이 낮은 PCR 효소가 필요하다. Prelude PreAmp Master Mix (Code 638541)는 10 pg 수준의 극소량의 cDNA / gDNA에 적용 가능하며 타사 대비 가장 편향성이 낮은 preamplification이 가능한 preamplification master Mix이다.

■ Method
Preamplification using cDNA
다양한 농도의 cDNA가 있는 Human Universal QUICK-Clone II cDNA (Code 637260)를 각 실험의 cycle로 Prelude PreAmp Master Mix, TaqMan PreAmp Master Mix, SsoAdvanced PreAmp Supermix, PerfeCTa PreAmp SuperMix 이 네 가지의 제품을 사용해 제조사의 protocol에 따라 preamplification 하였다. 이후 cell cycle에 관련된 88개의 유전자와 8개의 housekeeping 유전자를 가진 PrimerArray Cell Cycle (Human) panel과 SmartChip TB Green Gene Expression Master Mix (Code 640211)을 사용해 SmartChip Real-Time PCR System (Code 640022)에서 분석하였다. 이후 이 결과를 GAPDH로 보정하여 ΔΔCt 값을 분석하였다 (in Livak and Schmittgen 2001). 이때, ±0.75의 threshold가 amplification의 편향성 여부의 기준으로 사용되었다.

Preamplification using RNA from FFPE tissue
FFPE 조직 샘플에서 NucleoSpin totalRNA FFPE을 사용하여 RNA를 추출하고 PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time) (Code RR036A)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 14 cycle로 Prelude PreAmp Master Mix 또는 TaqMan PreAmp Master Mix을 각 제조사의 protocol에 따라 preamplification 하였다. 이후 custom의 162개의 유방암 타겟 panel과 SmartChip TB Green Gene Expression Master Mix (Code 640211)를 사용해 SmartChip Real-Time PCR System (Code 640022)으로 분석하였다. 이후 결과를 GAPDH로 보정하여 ΔΔCt 값을 분석하였고 (in Livak and Schmittgen 2001), ±0.75의 threshold가 amplification의 편향성 여부의 기준으로 사용되었다.