Adapter는 NGS 장비가 인식할 수 있는 고유한 염기서열을 가진 oligonucleotide로써, library 제작 방식에 따라, ligation 혹은 PCR 등의 방식으로 분석하고자 하는 DNA에 부착된다.

Index 혹은 barcode는 각 샘플별로 부여되는 임의의 서열로, 이를 통해 분석 과정에서 각 reads가 어느 샘플에서 유래되었는지를 확인하게 된다. Single/dual/unique dual index 중 원하는 것으로 변경할 수 있으며, 어떤 종류를 선택하는 지에 따라 분석 정확도가 달라질 수 있다.

Single index를 포함하는 경우, P7 앞에만 index가 위치하게 되며, dual index 혹은 unique dual index를 포함하는 경우 P5 뒤와 P7 앞에 각각의 index가 위치한다.

Single-read flow cells로 분석하는 경우
-> 16 additional cycles of sequencing: 8 cycles for the Index 1 (i7) Read and 8 cycles for the Index 2 (i5) Read.

Paired-end flow cells로 분석하는 경우
-> 23 additional cycles of sequencing: 8 cycles for the Index 1 (i7) Read, 8 cycles for the Index 2 (i5) Read, and 7 nonimaging, chemistry-only cycles at the beginning of the i5 Read.

- Identifier 추가 도입으로 index hopping 등을 방지할 수 있어, 샘플 간의 구별 정확도 향상
- Flow cell의 lane 별로 multiplexing 할 수 있는 샘플 수가 많아, 더 많은 샘플을 한번에 분석
- Index 1 read (i7), index 2 read (i5)의 추가된 두 reads를 이용해 분석 진행

Index hopping (혹은 index switching)은 sequencing reads에 예기치 않은 index가 잘못 배치되는 것으로, 후속 분석에서 misalignment나 부정확한 결과로 이어질 수 있다. Unique dual index (UDI)를 적용하게 되면 이러한 index hopping 현상을 최소화 할 수 있어, 높은 민감도가 요구되는 실험에서는 UDI를 사용할 것을 권장한다.

- Library 제작 시, single index 보다는 dual index를 사용한다.
- Index의 adjacent cluster 수가 줄어들도록, PhiX spike-in의 비율을 높인다.
- Cluster density를 줄이기 위해 한번에 분석하는 library양을 줄인다.

Single-end reads로 분석하는 경우
-> 핵산의 한쪽 끝에서만 원하는 길이로 서열을 읽어낸다 (e.g., 50-, 75-, 혹은 100- bp reads)

Paired-end reads로 분석하는 경우
-> 핵산의 한쪽 끝에서 원하는 길이로 서열을 읽어낸 후, 반대의 핵산 끝에서도 반복한다.
-> Insertion, deletion, genomic rearrangements를 검출할 수 있다.

Single-indexed library로 paired-end sequencing을 진행할 수 있다. Sequencing을 진행하는데 있어, single 이든 pair 이든 어떤 index가 사용되었는 지에 따라 달라지는 것이 없다. 모든 library에서 sequencing은 Read Primer 1이나 2를 사용하여 진행할 수 있으며, dual-indexed kit를 이용했을 때에도 single reads를 사용할 수 있다.

양 말단에 index를 포함하고 있는 경우에도 single-read로 분석이 가능하다. 이 경우, 분석을 진행하고자 하는 flow cell에서 권장되는 실험 방식을 따른다 (e.g., single-read 혹은 paired-end). 만약, single-read를 사용하는 flow cell로 양 말단의 index reads 서열을 모두 읽고자 하는 경우, TruSeq^® Dual Index Sequencing Primer Box, Single-Read (Illumina, Cat # FC-121-1003)을 사용해야 한다.

어떤 샘플이든 multiplex로 분석할 수 있으나, 최상의 결과를 얻기 위해서는 아래 사항을 따를 것을 권장한다.
- 각 샘플 별 fragment length는 꼭 일치해야 한다. 다른 길이의 library를 하나의 flow cell에 섞어 분석하는 경우, 샘플 별 coverage가 일정하지 않아 다른 효율을 나타낼 수 있다.
- 하나의 flow cell에서 분석하는 샘플은 모두 같은 barcoding 방법으로 library를 구성해야 한다 (e.g., single-indexed 샘플과 dual-indexed 샘플을 섞어서 분석하지 않는다).
- 하나의 flow cell에서 분석하는 샘플은 모두 같은 종류의 barcode로 library를 구성해야 한다 (e.g., TruSeq^® barcoded 샘플과 Nextera^® barcoded 샘플을 섞어서 분석하지 않는다).
- Illumina^® library prep kit를 사용하지 않는 경우, Illumina^® index와 동일한 서열을 사용하거나 이미 알고 있는 서열의 index를 custom barcode로 사용한다.

Illumina^®사의 HiSeq^® 혹은 MiSeq^® 기기는 A와 C 염기를 읽기 위해 red laser/LED를 사용하고, G와 T 염기를 읽기 위해 green laser/LED를 이용한다. 각 cycle에서 red, green channel 모두 적절하게 읽혀야 하며, 만일 color balance가 맞지 않는 경우, index read의 서열이 분석되지 않을 수 있다.
Illumina^®사의 NovaSeq™, NextSeq^®, MiniSeq^® 기기는 two-color를 이용해 분석하게 되며, 처음의 두 cycle 내에서 index가 GC서열을 포함하지 않는 경우 분석이 개시되지 않기 때문에 적절한 index를 조합해야 한다.