적용 제품	적용 논문
SMARTer® Stranded RNA-Seq Kit	Bcl2l10 induces metabolic alterations in ovarian cancer cells by regulating the TCA cycle enzymes SDHD and IDH1
SMARTer® Stranded RNA-Seq Kit	Higher expression of KCNK10 (TREK-2) K+ channels and their functional upregulation by lipopolysaccharide treatment in mouse peritoneal B1a cells
SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian (Pico v3)	Identification of differentially expressed Legionella genes during its intracellular growth in Acanthamoeba
SMART-Seq® Stranded Kit	ZNF746/PARIS overexpression induces cellular senescence through FoxO1/p21 axis activation in myoblasts
SMART-Seq® Stranded Kit	RNA demethylation by FTO stabilizes the FOXJ1 mRNA for proper motile ciliogenesis

https://doi.org/10.3892/or.2021.7998
Bcl2l10 induces metabolic alterations in ovarian cancer cells by regulating the TCA cycle enzymes SDHD and IDH1
Su-Yeon Lee, Jinie Kwon, and Kyung-Ah Lee

아래 내용은 다카라코리아에서 직접 번역한 내용으로, 해석하는 과정에서 원작자의 의도와 상이한 내용이 포함되어 있을 수 있습니다. 학술 정보를 목적으로 하는 경우 원문을 참고하여 주시기를 바랍니다.


■ Abstract 미리보기


■ 논문에서 사용된 Takara 관련 제품 알아보기
SMARTer^® Stranded RNA-Seq Kit (Code 634836)

• SMART^® 기술을 이용해 cDNA 합성 및 Illumina^® 분석용 library 제작
• 전사체의 strand information을 확인할 수 있어, sense 서열만 특이적으로 분석 가능
• 100 pg-100 ng의 RNA (purified Poly A+ RNA 또는 rRNA depleted RNA)에서 Library 제작

https://doi.org/10.1007/s00424-021-02526-1
Higher expression of KCNK10 (TREK-2) K+ channels and their functional upregulation by lipopolysaccharide treatment in mouse peritoneal B1a cells
Si Won Choi, Joohan Woo, Kyung Sun Park, Juyeon Ko, Young Keul Jeon, Seong Woo Choi, Hae Young Yoo, Inseong Kho, Tae Jin Kim, Sung Joon Kim

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■ Abstract 미리보기
Serous cavity에 위치한 Innate-like CD5+ B1a 세포는 지질 다당류 (lipopolysaccharide, LPS)와 같은 자극에 의해 활성화되어, T cell independent한 항체 반응을 유도한다. 이온 채널은 항상성과 면역 세포 활성화에 중요한 역할을 하지만, B1a 세포의 전기생리학적 특성은 현재까지 연구된 바 없었다. 본 논문의 저자들은 이전 연구에서 mouse B cell lymphoma cell에서 전압에 independent한 two-pore-domain potassium (K2P) 채널이 음전하의 막전위를 형성하고, Ca2+ 유입을 유도함을 확인하였다. 본 논문에서는 mouse splenic follicular B (FoB), marginal zone B (MZB), peritoneal B1a cell에서 K2P 채널의 발현과 활성 정도를 새롭게 비교하였다. NGS 분석으로 FoB와 MZB 세포보다 B1a 세포에서 TREK-2 및 TWIK-2 전사체를 더 높게 발 현함을 확인하였다. 또한, patch clamp technique를 이용해 전기생리학적 분석을 진행했으며, FoB와 MZB 세포보다 B1a cell에서 더 특징적인 large unitary conductance (~250 pS)를 가지는 TREK-2 활성도를 더 높게 나타냈다. TREK-2는 2시간 이상 LPS 처리 시 더 높은 활성을 보였으며, 이는 FoB와 MZB 세포보다 B1a cell에서 더 두드러지게 확인되었다. B cell 세포질 내 Ca2+ 농도는 강한 K + 탈분극 (ΔRKCl (%))으로 인 해 감소하였으며, 이는 음막 전위로 인해 기저로 Ca2+ 유입이 유도됨을 시사한다. LPS를 처리했을 때 ΔRKCl 값은 B1a cell에서 유의한 증가 값을 보였으나, FoB와 MZB 세포에서는 보이지 않았다. 본 연구는 mouse primary B cell subset에서의 K2P 채널을 처음으로 비교하였으며, TREK-2의 기능적인 upregulation 와 B1a cell의 Toll-like receptor 4의 자극으로 인해 Ca2+의 유입이 증가되는 것을 증명하였다.

■ Takara 제품을 이용한 method 미리보기
Total RNA는 RiboGone-Mammalian (Code 634846)을 처리하여 rRNA를 제거하였으며, 이후 SMARTer^® Stranded RNA-Seq Kit (Code 634836)을 이용해 cDNA 합성 및 증폭을 진행하였다. SMARTer oligonucleotide와 Illumina^® adapter sequence를 포함하도록 single strand 형태의 1 st strand cDNA 합성 및 정제한 후, SeqAmp™ DNA Polymerase (Code 638504)를 이용해 PCR 18 cycle로 정제 산물을 증폭하고 그 과정에서 Illumina^® Index를 부가하였다. 제작된 library는 정제 및 size selection, normalization을 진행한 후, Illumina^® NextSeq 500 sequencer에서 75-bp paired-end reads (2 X 75)로 분석하였다.

■ 논문에서 사용된 Takara 관련 제품 알아보기
SMARTer^® Stranded RNA-Seq Kit (Code 634836)

• Stranded 정보를 포함하는 Illumina^® 분석용 library 제작
• Total RNA를 샘플로 사용하는 경우, 별도의 rRNA 제거 과정이 요구됨
• Mammalian cell (poly A+ RNA) 뿐 아니라, bacteria 샘플 (non-poly A+ RNA)에도 적용 가능

RiboGone™-Mammalian (Code 634846)

• Human, mouse, rat의 total RNA 샘플로부터 5S, 5.8S, 18S, 28S nuclear rRNA (Ribosomal RNA) 및 12S mtRNA (mitochondrial RNA)를 제거하는 시약

https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2020.e05238
Identification of differentially expressed Legionella genes during its intracellular growth in Acanthamoeba
Fu-Shi Quan, Hyun-Hee Kong, Hae-Ahm Lee, Ki-Back Chu, Eun-Kyung Moon

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■ Abstract 미리보기
Legionella는 포유류 macrophage (대식세포)와 같은 free-living amoeba 세포 내에서도 증식한다. 현재까지는 Acanthamoeba 세포 내에서의 Legionella의 전체적인 유전자 발현 패턴에 대해 모두 밝혀지지 않았다. Intracellular bacteria는 host의 gene expression을 변화시킬 뿐 아니라 생존에 관여하는 자신의 유전자 발현 또한 조절할 수 있다. 본 연구에서는 Acanthamoeba 내에서 Legionella를 24시간 동안 증식시키고, 그 기간 동안 발현하는 유전자가 어떻게 변화하는지를 비교 분석하였다. RNA sequencing 분석을 진행하여 intracellular Legionella가 발현하는 3,003개의 유전자를 확인하였고, 일반적인 free Legionella와 비교했을 때, 115개의 유전자가 2배 이상 과발현 되었고, 1,676개의 유전자는 2배 이상 더 낮은 발현을 보임을 확인하였다. Gene ontology (GO) 분석에서는 intracellular Legionella 내에서 molecular function 기준 ‘ATP binding’과 ‘DNA binding’으로 분류된 다양한 유전자가 발현되지 않는 것을 확인하였다. 독성과 항산화 스트레스 반응에 관여하는 alkylhydroperoxidase 효소의 발현은 배양 24시간 후에 매우 높아졌다. 에너지 생산을 활성화하는 Amino acid ABC transporter substrate-binding protein도 역시 높게 발현되었다. Aylhydroperoxidase, glucose pathway, Dot/Icm type IV secretion system과 관련된 유전자들은 차등적인 발 현을 보였다. 이렇게 얻은 결과들은 Acanthameoba 세포 내의 Legionella의 생존 전략을 더 심층적으로 이해하는 데 도움을 줄 수 있다.

■ Takara 제품을 이용한 method 미리보기
일반적인 free Legionella와 Acanthameoba 내에서 증식한 Legionella에서 추출한 각 total RNA 5 ug으로부터 Ribo-Zero Magnetic Kit를 이용해 rRNA를 제거하였다. 이후 SMARTer^® Stranded RNA-Seq Kit를 이용해 library를 제작하였다. rRNA-depleted RNA는 제조사의 매뉴얼에 따라 cDNA 합성과 shearing하였고, Illumina^® index 1-12를 부가하였다. Library를 제작한 후, fragment size 확인 및 정량 과정을 거쳐 HiSeq 2500 (Illumina^®)에서 paired-end로 분석을 진행하였다.

■ 논문에서 사용된 Takara 관련 제품 알아보기
SMARTer^® Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian (Pico-v3) (Code 634485)

• pg 수준의 극소량 샘플로부터 Illumina^® 분석용 RNA-seq library 제작 가능 (약 7.5 시간) - 적용 샘플: human, mouse, rat 유래의 total RNA (250 pg - 10 ng) 혹은 intact cell (10-1,000개)
  ** 위의 논문과 같이 human, mouse, rat 이외의 종에서 분석을 진행할 경우, rRNA를 먼저 제거한 후 제품에 적용할 수 있음.
• FFPC나 LCM, cell-free RNA등과 같이 낮은 quality RNA (RIN > 2)에서 재현성 높은 결과 확인
• UDI (Unique Dual Index)와 UMI (Unique Molecular Index)의 적용으로 분석 정확도 UP

https://doi.org/10.1038/s41419-020-2552-7
ZNF746/PARIS overexpression induces cellular senescence through FoxO1/p21 axis activation in myoblasts
Ju-Hyeon Bae, Hyeon-Ju Jeong, Hyebeen Kim, Young-Eun Leem, Dongryeol Ryu, Sang Chul Park, Yun-Il
Lee, Sung Chun Cho & Jong-Sun Kang

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■ Abstract 미리보기
산화스트레스 (Oxidative stress)를 포함한 다양한 스트레스는 근육 줄기 세포의 증식 능력 즉 근육 재생 능력을 저하시켜 근육의 노화 또는 근육 질환을 유발시킨다. ZNF746 (PARIS)는 E3 ligase Parkin의 기질로, 이의 축적은 파킨슨병과 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 myoblast 기능 중 PARIS의 역할을 연구하였다. PARIS는 myoblast에서 발현되고, 분화하는 과정에서 발현이 감소한다. PARIS overexpression은 세포 사멸의 유도 없이 myoblast의 증식과 분화를 모두 감소시켰던 반면, PARIS depletion은 myoblast 분화를 가속화했다. 흥미롭게도, myeloblast 혹은 fibroblast에서 높은 수준의 PARIS는 p53 signaling, 염증, 산화 스트레스에 대한 반응과 관련된 유전자 발현 변화 함께 세포 노화를 유도하였다. Myoblast에서의 PARIS overexpression은 산화스트레스를 더욱 심화시켰고, 항산화제인 Trolox 처리를 통해 PARIS 과발현으로 인한 증식 감소를 완화할 수 있었다. PARIS overexpression된 세포에서는 FoxO1과 p53 단백질 발현이 상승하여 p21 단백질의 개시를 유도하였으며, FoxO1과 p51 단백질이 고갈된 후에는 유도되었던 p21 수준을 감소시켰다. 또한, PARIS와 FoxO1 모두 p21 promoter 영역에서 recruit되었고, Trolox를 처리했을 때 FoxO1의 recruitment가 약화되었다. 이를 모두 종합했을 때, PARIS upregulation은 산화스트레스와 관련되어 있는 FoxO1과 p53 활성화를 유도하였고, 이는 p21의 개시와 myoblasts의 세포 노화를 유발한다는 것을 확인하였다.

■ Takara 제품을 이용한 method 미리보기
RNA sequencing을 위해 transfection된 C2Cl2 cell을 0.1% FBS가 포함된 배지에서 24시간 배양하였다. Transcriptional profile은 이바이오젠을 통해 분석하였다. Library는 total RNA로부터 SMARTer^® Stranded RNA-Seq Kit를 이용해 제작되었다. Poly (A) RNA Selection Kit (LEXOGEN)을 이용해 mRNA를 정제하였으며, 정제된 mRNA는 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA 합성 및 shearing하였다. 이후 Illumina^® index 1-12 를 부가하였으며, PCR을 통해 enrichment를 과정을 진행하였다. 합성된 library는 Aglient 2100 bioanalyzer를 이용해 fragment 크기를 점검한 후 qPCR로 정량 분석하였다. 이후 HiSeq 2500 기기에서 100 bp paired-end로 시퀀싱을 진행하였으며, TopHat software를 이용해 mRNA-Seq 결과를 mapping하여 데이터 분석을 진행하였다.

■ 논문에서 사용된 Takara 관련 제품 알아보기
SMART-Seq^® Stranded Kit (Code 634442)

• Single cell 수준의 샘플에도 적용 가능한 Illumina^® 분석용 RNA-seq library 제작 제품 (약 7시간)
  - 적용 샘플: 1 ~ 1000개의 세포 혹은 극소량의 total RNA (10pg - 10ng)
• Human, mouse, rat 유래의 rRNA를 제거하는 ZapR 기술을 활용하고 있어, 별도의 rRNA depletion
  과정 불필요
• FFPC나 LCM, cell-free RNA를 포함하는 낮은 quality RNA (RIN > 2)에서 재현성 높은 결과 확인
• Library 내 stranded origin 정보를 포함하고 있어, 분석 시간 및 비용 절감 가능

https://doi.org/10.1016/j.devcel.2021.03.006
RNA demethylation by FTO stabilizes the FOXJ1 mRNA for proper motile ciliogenesis
Hyunjoo Kim, Young-suk Lee, Seok-Min Kim, Soohyun Jang, Hyunji Choi, Jae-Won Lee, Tae-Don Kim, and V. Narry Kim

아래 내용은 다카라코리아에서 직접 번역한 내용으로, 해석하는 과정에서 원작자의 의도와 상이한 내용이 포함되어 있을 수 있습니다. 학술 정보를 목적으로 하는 경우 원문을 참고하여 주시기를 바랍니다.


■ Abstract 미리보기
Adenosine N6-methylation (m6A)는 매우 보편적으로 나타나는 mRNA 변형이지만 m6A 제거 현상(demethylation)의 생리학적 중요성은 아직 밝혀지지 않았다. 본 논문에서는 m6A demethylase FTO가 motile ciliogenesis의 보존 조절 인자로서 기능함을 확인하였다. FTO는 탈메틸화 작용으로 ciliary transcription factor인 FOXJ1에 코딩하는 mRNA를 안정화시키는 작용 기전을 가진다. Fto 결손 Xenopus laevis 배아에서는 motile cilia 결함이 다수 확인되었고, Foxj1이 주요 표현형 타겟 중 하나로 밝혀졌다. 사람 기도 상피 내에서 FTO 결손 또한 FOXJ1 mRNA의 불안정화를 유도하였고, 심각한 ciliated cell의 손실과 함께 주변의 goblet cell의 증가를 보였다. 알러지를 유발한 Fto knockout mice에서도 기도 상피 내의 ciliated cell의 결함으로 인한 심각한 천식과 유사한 형태를 확인하였다. 종합했을 때, 본 연구에서 embryonic ciliogenesis와 homeostatic ciliogenesis 간의 FTO-FOXJ1의 유전자의 역할이 주요함을 확인하였다.

■ Takara 제품을 이용한 method 미리보기
M6A-seq (또는 MeRIP-Seq)은 m6A-methylated RNA mapping 표준 실험 기법으로, m6A를 특이적으로 인식하는 항체와 negative control 역할의 input RNA를 사용해서 RNA의 서열을 확인하게 된다. 여기에서 충분한 양의 input RNA가 사용되었으며, standard mRNA-seq과 동일하게 병렬식으로 서열 분석되었다. 이 연구에서 해당 과정의 반복 실험을 진행하지 않았으나, RT-qPCR 등으로 대신하여 결과를 검증하였다.
Sequencing library는 SMARTer^® Stranded RNA-Seq Kit를 이용해 제작되었으며, 실험 과정은 제조사의 매뉴얼에 따라 진행했다. 정제된 m6A-seq library는 Illumina^® MiSeq에서 분석을 진행했으며, 분석 결과는 Gene Expression Omnibus (GEO)의 GSE167139로 등록되어 있다.

■ 논문에서 사용된 Takara 관련 제품 알아보기
SMART-Seq^® Stranded Kit (Code 634442)

• Single cell 수준의 샘플에도 적용 가능한 Illumina^® 분석용 RNA-seq library 제작 제품 (약 7시간)
  - 적용 샘플: 1 ~ 1000개의 세포 혹은 극소량의 total RNA (10pg - 10ng)
• Human, mouse, rat 유래의 rRNA를 제거하는 ZapR 기술을 활용하고 있어, 별도의 rRNA depletion 과정 불필요
• FFPC나 LCM, cell-free RNA를 포함하는 낮은 quality RNA (RIN > 2)에서 재현성 높은 결과 확인
• Library 내 stranded origin 정보를 포함하고 있어, 분석 시간 및 비용 절감 가능