비용, 처리량, 민감도 등의 이유로 현존하는 기술로는 실험의 아이디어를 검증하는 것이 불가능한 경우가 있다. 그러나 이러한 한계는 이를 극복하기 위한 기술 및 기기들을 빠르게 발전시켰다. 이러한 철학으로 우리는 single cell 연구의 한계를 뛰어넘는 개방적이고 유연한 플랫폼인 ICELL8 Single-Cell System을 개발하게 되었다.

이번에는 Stanford University에 Greenleaf lab을 소개하고자 한다. Takara Bio USA, Inc.와 함께 그들은 single cell ATAC-seq을 위한 간단하고 high-throughput인 workflow를 개발했고 (single-cell assay for transposase-accessible chromatin-seq (scATAC-seq)), 이 방법으로 4~5시간 만에 1,000개 이상의 cell에서 library를 생성했다.

■ Chromatin accessibility: a sequence of challenge
Chromatin은 서열 뿐만 아니라 그 구조 역시도 유전자 발현을 조절하는데 있어 중요한 역할을 한다. Chromatin의 리모델링은 DNA와 결합 단백질 및 전사인자에 대한 DNA의 접근성을 바꿔 전사를 촉진하거나 억제한다. 그러나 기존에 사용해 왔던 chromatin mapping 기술은 높은 비용, low-throughput, 복잡한 workflow 등으로 인한 문제를 겪어 왔다. 이러한 문제점들은 같은 조직이나 subtype이더라도 bulk cell과는 달리 뚜렷한 chromatin 패턴을 보이는 single cell을 분석하는 경우 더욱 심해진다.

■ A singular protocol: the new approach to map chromatin
이러한 문제점들을 극복하기 위해 Greenleaf lab은 Takara의 ICELL8 Single-Cell System을 사용하여 high-throughput scATAC-seq protocol (그림 1)을 개발했다. ICELL8 Single-Cell System에서 cell은 자동으로 single cell로 분리되어 ICELL8 350v Chip에 5,184개의 nanowell에 분주 및 이미지화 된다. 이때, CellSelect Software로 live single cells (assayed by Hoechst and propidium iodide dyes)을 가진 well 만이 자동적으로 선별되어, 이후 선별된 well에만 시약을 분주하는 것으로 시약과 시간을 아낄 수 있다. Transposition, index addition, and PCR amplification (그림 1, 패널 2-5)의 과정은 모두 chip 위에서 진행되어 직접 조작하는 단계를 최소화하여 실험 간의 재현성을 극대화했다. 이후 PCR amplicon을 chip 밖에서 pooling하여 size selection bead로 정제하는 것으로 sequencing을 위한 library를 준비하였다.


그림 1. ICELL8 Single-Cell System을 사용한 ATAC-Seq workflow 개요
세포들은 자동적으로 chip 으로 분주 및 이미지화 되어 live single cell well 만이 선별되고 (패널 1) Tn5 transposase을 포함한 transposition mix가 선별된 well에 분주 되어 thermal cycling 과정을 거친다 (패널 2). 이때 결합해 있는 transposase를 제거하기 위한 high-EDTA와 함께 index 1 이 분주 되고, 이후 EDTA를 불활성화 시키기 위해 high-MgCl2와 함께 index 2 가 분주된다 (패널 3-4). 마지막으로 chip에서 선별된 well이 PCR 되는 순서로 실험이 진행된다 (패널 5). Figure by Anja Mezger et. al., used under CC BY 4.0.

■ It pays to innovate: chromatin profiles reveal distinct cell types
monocytes, B cells, T cells과 같은 peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)는 기능이 매우 다양한 혈액 세포이다. Greenleaf lab은 세명의 개별 기증자로부터 받은 혈액으로 그들의 scATAC-seq protocol을 사용해 single PBMC의 chromatin profile을 분석했다. 놀랍게도 transcription factor start sites의 chromatin accessibility pattern을 분석한 결과 monocyte, B-cell 과 T-cell을 뚜렷하게 cluster로 그룹화했다 (그림 2). 이를 통해 복잡한 샘플 안에서도 이러한 방법을 사용하면 새로운 유형의 cluster를 그룹화 할 수 있다는 점을 확인할 수 있었다.


그림 2. PBMC의 scATAC-seq은 chromatin accessibility pattern을 바탕으로 clustering하는데 뛰어난 성능을 보인다.
모든 세포에서의 Chromatin accessibility (패널 A), PU. 1 (패널 B), C/EBPα (패널 C), RUNX1 (패널 D)은 monocytes, B-cell, T-cell에서 개별적인 cluster를 보인다. Figure by Anja Mezger et. al., used under CC BY 4.0.

■ ICELL8ing innovation: who's next?
Takara의 ICELL8 Single-Cell System은 다양한 assay의 개발 및 최적화를 위한 개방적이고 유연한 플랫폼을 제공한다. 이번에는 Stanford University의 Greenleaf lab에서 어떻게 이러한 시스템을 활용하여 high-throughput의 신속한 scATAC-seq protocol을 개발했는지를 살펴보았다. 반면 seminal article (Learning Center)을 보면 다른 연구자들이 ICELL8 시스템을 사용하여 어떻게 새로운 single-cell CUT&Tag technology를 개발했는지를 확인할 수 있다.

■ Reference
Mezger, A. et al. High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution. Nat. Commun. 9, 3647 (2018).

■ 원문
Accelerating chromatin mapping with single-cell ATAC-seq (takarabio.com)