심근 세포의 전사 변이 탐색 DATE: September 9, 2019

우리는 연구자로서 특정 생물학적 현상에 매료되고 이끌리지만, 특정 연구 주제는 때로는 매우 큰 한계가 있는 일부 세포 유형 또는 생물학적 모델을 필요로 하는 경우가 있다. 연구자가 직면할 수 있는 한계 중 하나는 사용 가능한 실험법과 실험해야 할 세포가 호환되지 않아 원하는 실험을 수행할 수 없는 경우이다.

이러한 세포 유형으로 인한 한계를 극복하기 위해 Takara Bio는 유연하고 개방적으로 ICELL8 system을 설계하여 연구자가 이전의 방법으로 적용하기 어려웠던 세포 유형에서도 single cell sequencing의 이점을 누릴 수 있도록 하였다. 이번 ICELL8 Innovator 시리즈 기사에서는 온전한 성체 마우스 심근세포에서 scRNA-seq을 수행하는 방법을 개발한 Max Planck Institute for Heart and Lung Research의 연구원을 조명하였다 (ICELL8 시스템을 사용하여 마우스 심근 세포 준비를 위한 단계별 프로토콜은 링크 참고).

Matters of the heart
대부분의 체세포는 이배체이지만 성인 심근 세포는 다양한 염색체 수를 가지며 세포당 두 개의 염색체 세트를 가진 두 개의 핵이 가장 일반적인 조합이다. Yekelchyk et al. 연구그룹은 단핵 및 다핵 심근 세포의 전사체를 조사하여 차이점이 존재하는지, 그리고 그러한 차이가 기능적 변화를 가져오는지 여부를 확인하고자 하였다.

단일 세포 RNA 시퀀싱은 이러한 질문에 답하기 위한 확실한 방법이지만 저자는 이 방법이 이전에는 온전한 성인 심근 세포에 적용할 수 없었다는 점에 주목한다. 한 가지 중요한 이유는 매우 큰 크기의 심근 세포가 microfluid 및 droplet 기반의 scRNA-seq 방법과 호환되지 않는다는 것이다. 또 다른 한계점은 핵 개수에 기반한 엄격한 사전 분류가 수행되지 않은 단일 핵 시퀀싱을 진행할 때에 핵 개수에 대한 정보가 소실된다는 점이다.


이러한 문제를 극복하기 위해 연구원들은 크기가 큰 심근 세포 (최대 200μm 길이)를 수용할 수 있는 너비가 큰구경 노즐을 가지는 ICELL8 시스템으로 전환하였다. 심근 세포 현탁액은 시간이 지남에 따라 침강되기 쉽기 때문에 연구원들은 플랫폼의 유연성을 활용하여 세포 현탁액이 자주 혼합되도록 분사 프로토콜을 수정하여 ICELL8 칩 전체에 걸쳐 심근 세포가 보다 균일하게 분포되도록 하였다 (그림 1).


그림 1. ICELL8 칩 전체의 심근 분포
(Yekelchyk et al. 2019 보충 자료 그림 1에서 발췌한 패널, CC-BY 4.0에 의거하여 사용 및 채택).
두 패널의 색상은 마이크로웰에 있는 상대적인 세포 수를 나타낸다. 패널 A. 기본 분사 프로토콜은 빠른 침강 속도로 인해 심근 세포가 이질적으로 분포하게 된다. 패널 B. 수정된 프로토콜은 심근세포를 칩 전체에 고르게 분주한다.

Don't miss a beat
scRNA-seq 데이터의 예비 주성분 분석은 심근세포가 두 개의 구분되는 클러스터를 형성하였음을 나타냈지만, 심도 있는 분석 결과, 클러스터링이 검출된 유전자의 절대 수와 관련이 있는 것으로 나타났다 (그림 2, 패널 A). ICELL8 기기에는 세포 분주 후 이미징 단계가 통합되어 있기 때문에 저자는 각 세포를 보고 이를 시퀀싱 결과와 연관시킬 수 있었다. 이러한 상세한 분석을 통해 클러스터 1을 형성한 세포가 막대 모양의 형태를 잃고 작은 크기에 흐릿한 셀 모양으로 가늠할 수 있는 세포 손상을 입었고, 이로 인해 RNA 분해가 일어났음을 확인하였다 (그림 2, 패널 A 및 B).

이번에도 연구자들은 온전하고 손상되지 않은 심근 세포가 존재하는 well만 처리하고 분석할 수 있도록 이미지 기반의 세포 선택 기준을 조정하기 위해 ICELL8 플랫폼의 개방성을 활용하였다. 세포당 평균 60만 reads 및 3,900개의 유전자가 검출된 scRNA-seq 데이터는 크기의 차이에도 불구하고 심근 세포의 상대적으로 균일한 분포를 나타내었고, 이는 증가된 배수성이 심근 세포 전사체에는 최소한의 영향만 미친다는 것을 나타낸다 (그림 2, 패널 C).


그림 2. scRNA-seq에 대한 개별 심근세포의 이미지 기반 추적은 인공 세포 클러스터링을 방지한다.
(Yekelchyk et al. 2019의 그림 1에서 발췌한 패널, CC-BY 4.0에 의거하여 사용 및 채택).
패널 A. 초기 PCA plot은 두 개의 하위 그룹으로의 심근 세포 클러스터링을 보여준다.
패널 B. 라이브러리 준비 전 클러스터 1 및 2의 심근세포 이미지 (2채널 reflection mode: DAPI 및 Cell Tracker [Texas Red]). 품질 관리에서 클러스터 1의 세포가 손상된 것으로 나타났다.
패널 C. Intact한 막대형 심근 세포의 PCA plot

이어서 연구자들은 심장 비대와 같은 병리학적 상태를 통해 이질성이 유발될 수 있는지 연구하였다. 심장 비대를 유도한 후, 그들은 심근 세포의 배수성 보다는 국소 조직의 환경 차이에 의해 유발되는 것으로 보이는 전사 차이를 발견하였다.

Making single-cell sequencing more accessible
단일 세포 시퀀싱은 야생형 및 질병 조건에서 세포 행동을 이해하는 데 매우 중요한 도구이다. 그러나 적절한 실험방법이 없으면 많은 세포 유형에 이 기술을 적용할 수 없었다. ICELL8 기술은 작은 핵에서 부터 크기가 큰 심근 세포에 이르기까지 광범위한 크기의 세포를 분주 및 처리하도록 설계되었다. 또한 이 시스템은 맞춤형 애플리케이션을 위한 새로운 분석법을 개발하고 최적화할 수 있는 유연성과 시퀀싱 데이터를 처리된 세포와 다시 연결하는 기능을 제공하여 연구자가 데이터를 더 깊이 이해할 수 있도록 한다. 막스 플랑크 연구원은 ICELL8 시스템을 사용하여 온전한 심근 세포에 scRNA-seq를 도입하는 것은 scRNA-seq 목표를 달성하기 위해 이러한 개방적이고 유연한 시스템을 연구에 사용한 좋은 예로 계속해서 많은 연구분야에 ICELL8 시리즈가 적용될 것으로 기대한다.

[원문] Change of heart: exploring transcriptional variation in cardiomyocytes

References
Yekelchyk, M., Guenther, S., Preussner, J. & Braun, T. Mono- and multi-nucleated ventricular cardiomyocytes constitute a transcriptionally homogenous cell population. Basic Res. Cardiol. 114, 36 (2019).