DATE: October 27, 2020

우리는 T 세포를 이해함으로써 면역 체계의 복잡성을 풀 수 있다. 이러한 세포는 적응 면역 반응뿐만 아니라 면역 종양학 및 자가 면역과 같은 조절되지 않은 면역학적 반응을 중재한다. T-세포 수용체 (T-cell receptor, TCR) 레퍼토리를 연구하는 많은 방법 중에서 차세대 시퀀싱 (NGS)이 가장 전체적인 관점을 제공하며 이 방법을 TCR-seq라고 한다.

그러나 상용화된 모든 NGS 키트 또는 자체 실험법이 동일한 성능을 발휘하지 않고, 각 방법 간의 미묘한 차이로 부진한 실험에서 성공적인 분석을 구분해낼 수 있다. 연구자들은 종종 NGS 키트 분야가 광범위하여, “내 연구에 가장 도움이 되는 NGS 방법은 무엇인가요? 라고 묻는다.

The fundamentals of TCR-seq
대부분의 TCR-seq 방법은 사용할 샘플에 따라 크게 분류할 수 있다. DNA 기반 방법은 세포당 한 종류의 단일 템플릿을 가지므로 개별 TCR 클론의 정량화에 더 적합한 것으로 생각되지만 비용이 많이 들 수 있다. RNA 기반 방법은 더 민감하고 TCR 분포와 유전자 발현의 정량적 정보를 제공할 뿐만 아니라 unique molecular identifiers (UMI)를 쉽게 적용할 수 있어 PCR 편향을 줄이고 변이체 및 희귀 돌연변이의 식별 정확성을 향상시킨다.

화학적 측면에서는 multiplex PCR (mPCR) 및 Rapid Amplification of cDNA Ends PCR (5' RACE-PCR)은 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 접근 방식이다. mPCR은 전체 V(D)J 재조합 또는 CDR3 영역을 특이적으로 증폭하기 위해 모든 V 및 J 생식계열 유전자 (C 유전자)를 표적으로 하는 프라이머 풀을 활용한다. 하지만 이는 편향적인 증폭을 야기하고, 잘못 증폭된 산물로 인해 결과가 왜곡될 수 있다. 한편, RNA 특이적 5' RACE-PCR은 mRNA 전사물의 알려진 C-유전자 영역을 표적으로 하는 단일 프라이머 세트를 사용한다.

TCR-seq 방법을 선택할 때 고려해야 할 4가지 핵심 요소는 재현성, 반복성, 민감도 및 특이성이다. 본 자료에서는 mPCR 또는 5’ RACE-PCR을 기초로 한 라이브러리 제작 및 시퀀싱에 주로 사용하는 9가지 학술적 또는 상업적 접근 방식으로 견고함과 정확성을 체계적으로 비교하는 것을 목표로 한 Nature Biotechnology에 게재된 Barennes et al.의 최근 연구를 소개한다.
중요한 점은 Barennes et al. 연구 그룹이 적용 샘플로 인한 변동을 최소화하기 위해 동일한 T 세포 샘플을 사용했다는 것이다.

Unpacking replicability and reproducibility of popular TCR-seq methods
연구자들은 V(D)J 재조합 모델을 사용하여 TCR α 및 β (TRA 및 TRB) 시퀀스에 대한 17개의 매개변수를 계산하고 각 매개변수에 대한 샘플 간의 JSD (Jense-Shannon divergence) 거리를 계산하였다. 그런 다음 V(D)J 사용 분포 간 JSD를 활용하여 비교 분석을 위한 하나의 방법 안에서와 각 방법 간의 통계를 정의하였다. 반복성은 동일한 방법으로 생산된 서로 다른 샘플 간의 거리로 측정되었으며 재현성은 두 가지 다른 방법으로 생산된 샘플 간의 거리로 측정되었다 (그림 1, 패널 E). 각각의 방법은 5' RACE-PCR법의 경우 RACE-#로, multiplex PCR은 mPCR-#로 라벨하고 익명화하였다. 테스트한 9가지 방법 중 최고의 성능을 나타낸 세 가지 방법, mPCR-1, RACE-3, RACE-5에 초점을 맞췄고, 각 방법은 아래의 Conclusion에서 자세히 확인할 수 있다.

Heatmap 결과는 RACE-3가 TRA와 TRB 모두의 반복성과 재현성에 대해 높은 점수를 받았고 상위 2개 방법 안에 랭크되었다. RACE-5는 TRA 재현성에서 RACE-3보다 순위가 높았지만 반복성에서는 RACE-3보다 뒤처졌다. 둘 다 5개의 다른 RACE-PCR 방법보다 더 낮은 scaled divergence를 보였다. TRB 분석의 상위 2개 방법을 비교했을 때, RACE-3는 재현성 측면에서 mPCR-1 외 8개를 능가했으며, mPCR-1은 TRB의 반복성에서 가장 높은 순위를 기록하였다 (mPCR-1에는 TRA 옵션이 없었고 RACE-5에는 TRB 옵션이 없었지만 RACE-3에는 TRA 및 TRB 옵션이 모두 제공됨).

Reviewing each method's sensitivity and specificity
고려해야 할 다음 기준으로는 민감도와 특이성이 있다. TCR-seq에서 민감도는 true rare clonotype 및 변이 빈도를 정확히 정량하는 것이고, 마찬가지로 특이성은 시퀀싱 오류를 true rare clonotype와 구별하는 것이다. 각 방법이 clonotype을 강력하게 캡쳐하는 능력을 평가하기 위해 연구자들은 동일한 세포 샘플 (45 TRA 및 63 TRB)의 108개 replicate에서 in silico 메타 레퍼토리를 생성했다. 이후, 편향을 최소화하기 위해 9개 데이터세트의 모든 clonotype을 풀링하고 singletons (1개의 세포에서 한번만 식별된 clonotype)을 제거한 후 재처리되지 않은 (UMI 통합 전) 데이터 세트만 선택하여 데이터세트 크기를 정규화하였다. 그런 다음 Meta-repertoire clonotype (MRC) 정량으로 각 방법의 민감도를 비교하였다.

RACE-3는 다른 RACE 방법의 10-20%와 비교하여 TRA의 경우 MRC의 최대 50%, TRB의 경우 최대 40%를 포함하는 데이터 세트를 생성하였고 (그림 5, 패널 A), TRA용 RACE-5와 TRB용 mPCR-1도 높은 MRC로 두드러졌다.
Replicate 당 캡처된 MRC의 백분율과 관련하여 RACE-3는 9개의 replicate에서 MRC의 최대 40%를 캡처했으며 MRC의 1% 미만을 감지하지 못하였다 (그림 5, 패널 B). RACE-5 및 mPCR-1은 각각 TRA 및 TRB에 대해 RACE-3과 유사하게 수행되었는데, TRA의 경우, 9개의 replicate에서 발견된 MRC의 빈도는 RACE-3의 경우 1%에서 0.001%, 다른 방법의 경우 1%에서 0.05% 범위였으며(그림 5, 패널 C, 왼쪽), 어떤 replicate에서도 검출되지 않은 clonotype은 10배에서 100배 낮은 존재비로 존재하였다. TRB에 대해서도 유사한 전체 패턴이 나타났고, RACE-3 및 RACE-5는 증가된 감도를 나타내어 각 방법이 특히 TRB 보다 TRA에서는 더 낮은 존재비에서 더 큰 비율의 clonotype을 검출할 수 있게 하였다.

Conclusions
조사된 TCR-seq 방법에서 희귀 클론의 다양성과 검출은 초기 샘플의 유형과 양에 크게 의존하는 것으로 밝혀졌다. mPCR은 낮은 재현성으로 최대 다양성을 검출하는 데 최적인 반면, 5' RACE-PCR은 특정 clonotype의 빈도를 보다 정확하게 정량화하였다. 후자의 경우 저자는 UMI 기반 방법으로 더 높은 정확도를 제공할 수 있다고 제안하였다. 지속적으로 높은 점수를 받은 세 가지 방법은 mPCR-1 (Adaptive Technology의 immunoSEQ), RACE-3 (Takara Bio의 SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit*)와 RACE-5 (template switch oligo를 사용하는 Eugster et al.의 자체 프로토콜)이다.
* SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit는 SMART-Seq^® Human TCR (with UMIs)로 리뉴얼 되었습니다.

표 1의 최종 분석에서 Eugster et al. 방법의 반복성이 TRA에 최적임이 입증되었지만 SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit*는 민감도까지도 높아 Eugster et al. 방법과 Adaptive Technology의 immunoSEQ 방법에 필적할 만하였다. SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit는 TRA 및 TRB 레퍼토리 프로파일링 옵션을 모두 제공했을 뿐만 아니라 다른 8가지 방법에 비해 반복성, 신뢰성 및 민감도 측면에서 전반적으로 지속적으로 높은 순위를 기록하였고, TRA 및 TRB의 신뢰성과 TRB 반복성에서 1위를 차지한 것으로 확인되었다.

다카라바이오는 항상 고객 여러분께 고품질의 혁신적인 제품을 제공하기 위해 노력하고 있고, 이러한 놀라운 성능에 더 나아가기 위해 본 연구에서 사용된 TCR v1 제품을 UMI를 포함하는 새로운 SMART-Seq^® Human TCR (with UMIs)로 업그레이드하였습니다.
본 연구가 TCR-seq 연구 방법을 간소화하고 실험에 적합한 방법을 찾아가는 데에 도움이 되길 바랍니다.

[원문] TCR-seq methods: strengths, weaknesses, and rankings

References
Barennes, P. et al. Benchmarking of T cell receptor repertoire profiling methods reveals large systematic biases. Nature Biotechnology, 1-10 (2020).

Eugster, A. et al. Measuring T cell receptor and T cell gene expression diversity in antigen-responsive human CD4+ T cells. Journal of Immunological Methods, 400-401(1), 13-22 (2013).