Hematopoietic cell과 같은 일부 세포는 높은 역가의 lentivirus 혹은 retrovirus 에서도 transduction이 잘 되지 않는 문제가 있다. 이러한 낮은 transduction 효율은 viral receptor의 낮은 분포, 세포와 바이러스 간 약한 상호작용, transduction inhibitor의 존재 혹은 독성 등에 민감한 target 세포 등에 의한 영향으로 추정된다. RetroNectin^®을 사용하면 lentivirus 혹은 retrovirus와 target 세포의 거리를 물리적으로 좁혀 (colacalization) transduction 효율을 극적으로 개선할 수 있다.

What is RetroNectin^®?
RetroNectin^®은 3개의 domain (cell-binding domain, heparin-binding domain, CS-1 sequence)으로 구성된 재조합 human fibronectin fragment (rFN-CH-296)으로, lentivirus/retrovirus transduction 효율 또는 T cell 확대배양 효율을 높이기 위해 사용할 수 있다.

제품 원리 동영상


RetroNectin^® 제품 리스트

Code	제품명	용량
T100A/B	RetroNectin® (Recombinant Human Fibronectin Fragment)	0.5 ㎎ / 2.5 ㎎
T101A/B	RetroNectin® Pro (Recombinant Human Fibronectin Fragment)	0.5 ㎎ / 2.5 ㎎
T110A	RetroNectin® Dish (RetroNectin Pre-coated Dish, 35 mmφ)	10 dishes
T202	RetroNectin® GMP grade (Recombinant Human Fibronectin Fragment CH-296)	2.5 ㎎ (2.5 ㎖)

How does RetroNectin^® work?

그림 1. RetroNectin^®의 구조 및 transduction enhancement 매커니즘 가설.

RetroNectin^®은 lentivirus 또는 retrovirus를 이용한 transduction 시 바이러스와 target 세포의 colocalization을 도와 transduction 효율을 높여준다. 이때 바이러스는 RetroNectin^®의 H-domain에 결합하고, target 세포의 integrin receptor가 RetroNectin^®과 결합 (세포의 VLA-4와 fibronectin CS-1 site 간 결합 또는 세포의 VLA-5와 fibronectin C-domain 간 결합)함에 따라 세포와 바이러스가 물리적으로 가까워져서 VLA-4 또는 VLA-5 integrin receptors 발현 세포의 viral-mediated gene transfer 효율을 높인다.

• VLA-4 발현세포 - T-cells, B-cells, 단핵백혈구 (monocytes), NK cells, 호산구 (eosinophils), 골수 단핵세포 (bone marrow mononuclear cells), 림프구 전구세포 (lymphoid progenitor) 등
• VLA-5 발현세포 - 흉선세포 (thymocytes), activated T-cells, 비만세포 (mast cells) 등

Will RetroNectin^® reagent work for any cell type?
RetroNectin^®은 위에서 나온 예시와 같은 VLA-4 혹은 VLA-5 integrin을 발현하는 세포에서 매우 효과적이며, target 세포가 VLA-4 또는 VLA-5을 발현하는 것이 중요하다.

Cell transduction efficiency with RetroNectin reagent
세포 type	Gene transfer 효율 (%)
TF-1	53.3
HEL	28.1
NIH/3T3	80.5
CD34+ BMC*	86.9
Mouse BM MNC**	29.2
K-562	93.5
HL-60	89.4

* Bone marrow cells
** Bone marrow-derived mononuclear cells

Does RetroNectin^® reagent improve transduction when receptor expression is low?
아래의 표는 세 종류의 stem cell (human hematopoietic stem cells; hCD34+, human adipose-derived stem cells; hADSC, human mesenchymal stem cells; hMSC)에서 GaLV envelope의 receptor인 Pit 1과 VLA-4 integrin, VLA-5 integrin의 유전자의 발현 정도를 보여준다. 이러한 세포에 다양한 transduction enhancer를 사용하는 방법 (RetroNectin^®, Polybrene, Protamine)의 transduction 효율을 재조합 형광 단백질을 발현하는 바이러스를 활용하여 비교하였다. 그 결과 RetroNectin^®은 GaLV envelope의 receptor인 Pit 1의 발현이 낮은 hCD34+ 와 hADSC 같은 stem cell에서도 바이러스의 transduction 효율이 매우 높았다.

VLA-4, VLA-5, Pit 1 유전자의 발현
	hCD34+	hMSC	hADSC
VLA-4	+	-	+
VLA-5	+	+	+
Pit 1*	0.36	1.00	0.31

* hMSC 대비 Pit 1 유전자 발현


그림 2. Human stem cell에 다양한 transduction enhancer의 retrovirus를 사용한 gene transfer 효율 비교
RetroNectin^®은 다양한 envelope의 lentivirus 혹은 retrovirus에 사용이 가능하여 VSV-G, ecotropic, amphotropic의 retrovirus 및 lentivirus에 적용이 가능하며, 이외 GALV-type envelope의 retrovirus에도 적용이 가능하다.

How does the use of RetroNectin^® reagent avoid cell exposure to transduction inhibitors and other toxic substances from viral supernatants?
RetroNectin^® 은 다음의 두 가지 방법 중 하나를 선택해서 사용한다.

• Supernatant (SN) infection method - 세포와 virus supernatant를 섞어 RetroNectin^®이 코팅된 plate에 넣어주는 방법
• RetroNectin^®-bound virus (RBV) infection method - RetroNectin^®이 코팅된 plate에 retrovirus 또는 lentivirus를 먼저 결합시킨 다음 virus supernatant를 제거하고 세포를 추가하는 방법

RBV 방법을 이용할 경우, supernatant를 먼저 제거하고 target 세포를 추가함으로 viral-mediated gene transduction을 저해하는 바이러스의 packaging cell 유래 다양한 저해물질 (proteoglycans, 외피단백질 등)을 제거하여 transduction 효율을 높일 수 있다는 장점이 있다.


그림 3. RBV infection method workflow 이러한 방법은 특히 기존 방법으로는 어려웠던 실험의 transduction 효율을 극적으로 높인다.

Do you sell Clinical Grade RetroNectin^® reagent for ex vivo gene therapy?
RetroNectin^® GMP Grade는 임상시험용의약품 (Investigational Product)을 위해 GMP 가이드라인을 준수한 시설에서 생산된 고품질 시약으로 별도의 물질 이전계약 (Material Transfer Agreement; MTA)없이 ex vivo 임상시험에 사용할 수 있다. 또한, 미국식품의약국 (U.S. Food and Drug Administration)에 Drug Master File (DMF) 제출이 완료된 제품으로, 전 세계적으로 44처의 기관에서 약 68건 이상의 gene therapy 임상실험이 진행되었다.


그림 4. 유전자 치료제 분야에서의 RetroNectin^®