CAR-T는 암세포가 세포 표면에서 발현하는 특정 항원을 인식하는 CAR (chimeric antigen receptor) 유전자를 환자 유래의 림프구 (T-cell)에 도입하여 다시 체내에 주입하는 치료법이다. 이때 일반적으로 lentivirus와 같은 바이러스 벡터가 사용되지만 여러 후보군의 CAR 유전자 기능을 평가하는 경우 바이러스 벡터를 매번 만드는 것은 초기 실험 단계에 장애물이 될 수 있다. 따라서 이 연구에서는 in vitro transcription (IVT*)으로 합성한 mRNA를 활용해 CAR 유전자를 T-cell에 도입하여 mRNA CAR-T cell을 일시적으로 생성한 후 그 기능을 평가하였다. mRNA의 delivery에는 미국 MaxCyte에서 개발한 전기천공법 (electroporation) 장치인 ExPERT System을 사용하였다.


* 당사에서는 시중에서 가장 높은 mRNA 합성 수율을 자랑하는 Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)와 mRNA 합성에서 사용 가능한 template plasmid를 제작하는 kit인 Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)을 판매하고 있음.

■ Result
1. 시간대별 CAR 유전자 발현율 변화
MaxCyte ATx를 사용하여 T-cell^*1에 anti-CD19 CAR mRNA^*2를 도입 후 3시간에서 96시간까지 시간별로 CAR유전자 발현율 (원문, 양성율)을 측정하였다. 그 결과, 도입 후 3시간부터 CAR 유전자의 고발현이 확인되었고, 도입 24시간 후 90%의 세포에서 CAR 유전자를 발현했다. 그 후 CAR 유전자는 점차적으로 발현이 감소하여 96시간 뒤에는 거의 소실되었다 (그림 1A). 또한 전기천공 후 세포 증식율을 확인한 결과 mRNA 비도입군과 유사하였다 (그림 1B).
^*1 RetroNectin^® (Code T100A)법으로 유도한 후 10일간 확대배양하여 사용하였으며 순도는 약 90%였음.
^*2 Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)으로 합성하였으며, Capping에는 CleanCap Reagent AG (TriLink사) 제품으로 capping였음.



2. 세포독성 측정
Anti-CD19 mRNA를 도입한 다음 날 mRNA CAR-T 세포를 CD19 positive인 NALM-6세포 (급성 림프성 백혈병 유래)와 공동배양하여 세포독성을 측정하였다 (그림 2A). 그 결과, mRNA CAR-T 세포는 lentivirus로 제작한 CAR-T 세포^*3와 유사한 세포독성을 보였다 (그림 2B).
^*3 Lentivirus (LVpro™ Packaging Mix (Code 6195)로 제작)를 이용하여 CAR 유전자를 도입하였으며 CAR 유전자의 발현율은 약 90% 였음.



■ 관련제품
- 한번에 200 ㎍ mRNA 합성, 고수율 in vitro transcription: Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)
- IVT용 Plasmid template을 간단하게 제작하는 Kit: Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)
- Transformation시 Poly(A)등의 반복서열을 안정적으로 유지: Takara Stable Competent Cells (Code 9132)
- dsRNA 혼입이 적어 임상분야 연구개발에 적합: PrimeCap™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA) (Code 2560A)
- Lentivirus transduction enhancer와 T-cell 확대배양을 동시에: RetroNectin^® (Code T100A 외)
- HIV-1 유래 서열을 최소화한 3세대 Lentivirus 시스템: LVpro™ Packaging Mix (Code 6195 외)
- Transfection 시약 전문 브랜드 Mirus의 mRNA 전용 Transfection 시약: TransIT^®-mRNA Transfection Kit (Code MIR 2250)
- Cloning시 CDS서열을 정확하게 PCR: PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase (Code R050A)