제품 특징

• The Cas9 protein solution is sterile and well-tolerated by mammalian cells
• Highly efficient editing when combined with Guide-it Complete sgRNA Screening System (Code 632636)
• Minimizes off-target effects-better than plasmid-based delivery systems
• Works well in hard-to-transfect cell lines

제품설명

Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)은 Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 재조합 단백질로써 CRISPR/Cas9 gene editing 실험에 사용할 수 있도록 C-terminal nuclear-localization signal (NLS) 변형이 되어 있다. Cas9-sgRNA ribonucleoprotein(RNP) 복합체의 electroporation은 빠른 시간 내 gene editing이 가능하도록 하며, 또한 off-target effect를 최소화 할 수 있다.
본 제품은 Transfection 시약에 의한 RNP delivery에도 적용 가능하며, 이 경우 Mirus의 TransIT-X2 Dynamic Delivery System (Code MIR 6000) 사용을 추천한다 (그림 4. 참조)

그림 1. Gene knockouts in the Cellartis hiPSC-18 cell line. The strength of the cleaved bands gives a semiquantitive estimate of the percentage of edited cells. As can be seen, the Guide-it recombinant Cas9, when combined with sgRNA from the Guide-it In Vitro Transcription Kit, provides consistent and effective gene editing for many targets. Numbers at the bottom of each gel represent gene editing efficiencies (expressed as a %) for the indicated RNPs.


그림 2. Homology-directed repair at the AAVS1 or CXCR4 genes. A template containing a HindIII restriction site was inserted into the AAVS1 gene, and a template containing both a HindIII and a BamHI restrictrion site was inserted into the CXCR4 gene. Gene targets were then amplified from target cells using PCR and analyzed by restriction digest. Editing efficiencies are shown above each positive well on the gel. The extra band in the BamHI digest of the CXCR4 gene is due to a second BamHI site already present in the wild-type gene before editing.


그림 3. Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)과 타사 Cas9 단백질의 Konck-out 효율 비교
Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)과 타사의 Cas9 protein을 이용하여, Human iPS cell에서 CD81 유전자를 타겟하는 sgRNA-Cas9 RNP 복합체를 Neon Transfection System (Thermo Fisher Scientific)으로 Electroporation 도입하였다. 그 결과, 타사의 Cas9 단백질에 비하여 월등히 높은 Knock-out 효율을 얻을 수 있었다 (자사 실험데이터, n=2x3 times)


그림 4. Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)와 TransIT-X2를 이용한 iPS cell gene editing
PPIB (Cyclophili B)에 대한 2개의 guide RNA (gRNA)와 Cas9 protein (타사 제품 또는 Guide-it Recombinant Cas9 protein) 복합체 (RNP)를 형성하였다. 그 후, RNP 복합체를 TransIT-X2 Dynamic Delivery System (Code MIR 6000) (1㎕/well 첨가, 24-well plate, Mirus Bio) 를 이용하여 iPS cell (KOLF-2, Wellcome Trust Sanger Institute)에 Transfection 방식으로 도입하였다. 여러 농도의 guide RNA를 조합한 RNP 복합체 도입 후, T7E1 mismatch detection으로 절단 효율을 확인한 결과 타사 제품 대비하여 보다 높은 절단효율을 확인할 수 있었다.

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Application Note