PCR (Polymerase Chain Reaction)이란,
in vitro에서 DNA (또는 RNA로 합성한 cDNA) 중 목적유전자를 대량으로 증폭하는 기술이다.

Step 1. Template (DNA) 가닥의 열변성 (denaturation)
Step 2. Primer의 결합 (annealing)
Step 3. Polymerase에 의한 상보적인 가닥의 합성 (extension)

위 과정을 반복적으로 수행함으로써 두 개의 primer 사이에 위치하는 유전자를 몇 시간 만에 최소 10⁵배로 증폭할 수 있다.
PCR은 생물 시료 등에서 정제한 DNA (template)와 DNA polymerase, dNTP, primer 등을 혼합하여 반응액을 조제하며, thermal cycler에서 반응 후 증폭된 DNA 산물을 agarose gel 전기영동으로 확인할 수 있다 (그림1) .



PCR 반응의 필수 요소
· 내열성 DNA polymerase : DNA를 기반으로 DNA를 합성하는 DNA dependent DNA polymerase 사용.
· Template : 증폭하고자 하는 서열이 포함된 DNA 또는 cDNA · dNTP: DNA polymerase가 template에 상보적인 가닥을 합성하기 위한 재료 (dATP, dTTP, dCTP, dGTP 총 4종류의 deoxyribonucleotide를 필요로 하며, 주로 mixture 형태를 사용)
· Primer : template 중 증폭하고자 하는 영역을 타겟하며 DNA
polymerase가 DNA 합성을 시작하도록 말단에 3’-OH기를 제공

 

PCR은 통상적으로 다음의 세 가지 반응단계로 이루어진다.

Step 1. DNA denaturation (DNA 변성)
일반적으로 double strand DNA를 94℃에서 15~30초간 처리하여 각각 single strand로 분리한다. 너무 온도를 높이거나 시간을 지나치게 늘리면 내열성을 가진 DNA polymerase라도 활성을 잃게 되므로 주의한다.

Step 2. Primer annealing
고온에서 denaturation된 DNA와 primer를 섞은 후 온도를 낮추면 한 세트의 primer는 각각 상보적인 single strand DNA (template)에 결합한다. Annealing에 가장 적합한 온도와 시간은 primer의 서열과 길이에 따라 결정되며, 일반적으로 55℃에서 30초~1분간 annealing 한다.
Annealing 온도를 높이면 primer와 주형 DNA간의 mismatch가 감소되어 반응 특이성이 높아질 수 있다. 반면, 임의로 mismatch를 가지는 primer를 사용하려면 37~45℃로 annealing 온도를 낮춰줄 수도 있다.

 

Step 3. Extension 반응
반응액에 포함되어 있는 DNA polymerase는 주형 DNA에 결합한 primer로부터 네 종류의 기질 (dNTP)을 사용하여 주형에 상보적인 가닥을 신장시킨다. 신장반응에 필요한 시간은 주형 DNA 양, 증폭 단편의 길이, 반응 온도 등에 따라 다르지만 일반적으로 Thermus aquaticus (Taq) polymerase를 사용할 경우 72 ℃에서 ~10분간 약 10 kb를 합성하므로 이 속도를 고려하여 extension 시간을 설정한다 (일반적으로 1 kb 당 1분).
PCR 특이성을 높이기 위해 primer annealing 단계와 extension 단계를 동일온도에서 반응하는 shuttle PCR (2 step PCR)도 적용해 볼 수 있으며, 특히 타겟의 길이가 긴 경우 특이성을 높임과 동시에 반응시간도 단축할 수 있어 권장되기도 한다.

※ Cycle 수
이론적으로 PCR을 n회 cycle 수행하면 타겟서열이 2ⁿ배로 증폭되어야 하지만, 실제 실험상 PCR 반응에서는 이보다 효율이 낮다고 알려져 있다. 이는 cycle이 반복되면서 DNA polymerase의 효율이 점차 저하되고, 반응 산물이 증가됨에 따라 효소분자와 주형 비율에 불균형이 발생되기 때문이다. 또한 반응 산물간의 annealing 속도가 빨라져 primer annealing과 경합하기도 하며, pyrophosphate가 축적되어 효소반응이 저해될 수도 있다.
일반적으로 25~35 cycles로 반응하고 증폭산물의 양이 많아짐에 따라 증폭 단편 자체가 primer로 작용하여 2차적인 반응을 일으켜 비특이적인 DNA가 증폭될 수 있으므로 반응 cycle을 필요 이상으로 늘리는 것은 바람직하지 않다.

PCR 반응에는 아래와 같은 구성요소가 필요하다.

① DNA polymerase (내열성)
다양한 종류의 내열성 DNA polymerase가 시판되고 있으며, 각 반응에 사용되는 최적의 buffer 조성이 다르므로 각 효소의 활성에 최적화되어 있는 전용 buffer를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 반응온도 (extension 온도) 설정 시, TaKaRa Ex Taq^®은 72℃, high fidelity PCR 효소인 PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase는 68 ℃를 권장하는 등, 각 효소에 따라 최적의 반응온도가 다르다.

② Mg²⁺ 이온
일반적으로 PCR 반응에서는 1.5~2.5 mM의 Mg²⁺ 가 필요하다. Mg²⁺ 양은 PCR 시 1) 효소의 활성, 2) primer의 annealing, 3) 합성된 DNA의 fidelity, 4) primer-dimer의 형성 등에 관여한다. 주형으로 사용할 DNA 용액 내에 포함되어 있는 chelator (e.g. EDTA)가 반응액 속의 Mg²⁺ 농도에 영향을 미칠 수 있으므로 주의한다.
최적의 Mg²⁺ 양은 dNTP 양과도 관계가 있으므로 최적의 Mg²⁺ 농도를 결정할 때는 반드시 dNTP 농도도 고려해야 한다. 일반적으로 Mg²⁺ 농도가 높아지면 DNA 합성의 정확도에 영향을 미치고, double strand DNA의 denaturation이 어려워질 뿐만 아니라, Taq polymerase를 기준으로, 10 mM MgCl₂를 넣으면 ~50%까지 활성에 저해를 받을 수 있어 과잉 첨가하는 것은 권장하지 않는다.

③ 주형 DNA, RNA
PCR에는 여러 가지 형태의 DNA를 주형으로 사용할 수 있다. PCR 반응액 안에 10⁵~10⁶ 분자에 해당하는 주형 DNA가 있으면 양호한 결과를 얻을 수 있는데, 이는 human genomic DNA 1 ㎍, E. coli DNA 1 ng에 해당한다. RNA로부터 PCR을 하고 싶다면, 다양한 RNA 정제 kit로 RNA를 정제한 후 (PrimeScript™ Reverse Transcriptase) 등의 역전사 효소로 RNA에서 cDNA를 합성하여, 이를 주형으로 PCR 한다.

 

④ dNTP
dNTP는 PCR 반응의 기질로 일반적으로 20 ~ 200 μM 범위로 사용하며, dNTP 농도에 따라 DNA polymerase가 잘못된 dNTP를 결합시키는 mismatch 현상이 나타날 수 있다. dNTP 농도를 낮추면 mispriming이 감소하여 PCR 특이성과 정확도가 높아지지만, 반응액 내의 Mg²⁺ 농도에 따라 최적의 dNTP 농도가 달라지므로, 이 두가지를 모두 고려해서 최적의 조건을 검토하는 것이 필요하다.

간혹 PCR 반응 시 carryover contamination을 방지할 목적으로 dTTP 대신 dUTP가 포함된 dNTP mixture를 이용하기도 한다. 이 경우, PCR 후 uracil-N-glycosylase (UNG)를 처리해 원치 않게 혼입된 DNA를 분해하여 보다 정확한 검출을 할 수 있다

이처럼 일반적인 A, G, T, C 이외의 염기를 가진 nucleotide를 사용하는 PCR의 경우, 각 방법에 적합한 DNA polymerase를 함께 고려해야 한다.


*일부 자료는 다카라코리아가 발간한 ‘백전백승 PCR 가이드’ 에서 발췌하였습니다.