Introducing a tyrosinemia-related SNP in hiPS cells
유전자 편집에서 가장 강력한 방법 중 하나는 homology-directed repair (HDR) pathway를 이용하여 세포의 특정 유전자 부위를 정확하게 바꾸는 것이다. 이 방법을 이용하면, 단일 염기 변형(single-nucleotide polymorphisms, SNPs)부터 fusion tag나 발현하고자 하는 DNA와 같은 긴 길이의 삽입까지도 가능하다. 건강한 사람과 환자로부터 유전형이 보존된 Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)을 제작하면, 특정한 유전자 변형이 유전자 기능에 미치는 영향을 비교연구할 수 있다.
예를 들면, 먼저 건강한 사람으로부터 hiPSC를 제작하여 목적 세포로 분화되는 지까지 확인한다. 그 후에, 질병과 유관하다고 알려져 있거나 의심되는 유전자를 유전자 편집을 통해 hiPSC에 삽입하면 질병과 연관된 세포주를 구축할 수 있다. 또 다르게는, 환자로부터 질병 유전자를 포함하는 hiPSC를 제작하고, 해당 질병을 치료할 수 있도록 유전자를 편집하여 세포주를 구축한다. 이렇게 제작한 hiPSCs를 이용하면, 유전자 다양성에 따른 질병 연구와 치료제에 활용할 수 있다.
다카라바이오는 CRISPR/Cas9을 이용해 질병과 관련된 SNP를 세포에 도입한 후, single cell cloning과 스크리닝 과정을 통해 편집된 세포주를 구축하는 방법을 최적화했다 (그림 1). 이 과정에서 tyrosinemia에 관여하는 SNP가 도입된 세포주를 얻었으며, 이 세포주가 pluripotency와 정상 핵형을 유지하고 있음을 확인하였다. 또한, 이렇게 편집된 hiPSC를 간세포로 분화하여 tyrosinemia 연구를 위한 질병 모델 연구의 가능성도 확인하였다.
그림 1. CRISPR/Cas9로 편집한 hiPSCs를 이용해 질병 모델 구축
0. Experimental workflow
먼저,
Cellartis® DEF-CS™ 500 Culture System을 이용해 미분화 상태를 유지하는 homogeneous한 hiPSC를 배양하였다. 이후, Tyrosinemia와 관련되어 있는
FAH (fumarylacetoacetate hydrolase) 유전자의 c.786G>A (p.Trp262Ter) 위치에 SNP를 도입할 수 있도록 200 nt 정도의
ssDNA HDR template를 제작하여 Cas9, sgRNA와 함께 electroporation 시켰다. 이 때, Cas9과 sgRNA는 off-target effect를 줄이기 위해, ribonucleoprotein (RNP) 형태로 세포 내 도입되었다. Electroporation 이후,
SNP 검출 제품을 이용하여 편집된 hiPSC를 확인하였고, single cell로 분리 배양하여 세포주로 구축하였다. 각 세포주들은 별도의 선별 과정 없이 c.786G>A로 치환되었음이 확인 되었으며, 이후 간세포로 분화하여 정상 간기능을 유지하는지 분석하였다.
그림 2. Tyrosinemia와 관련한 SNP를 도입한 세포주 구축과 hepatocyte로의 분화 과정
1. sgRNA and ssDNA design
성공적이고 효율적인 유전자 편집을 위해서는 실험 디자인이 매우 중요하기에, sgRNA의 scaffold 서열을 최적화함으로써 Cas9과의 친화력을 높여 더 안정적인 복합체로 구성하고자 했다. 이를 위해,
FAH 유전자의 10번 exon 내 원하는 위치를 절단할 수 있는 두 종류의 sgRNA를 선택하였다. 이 후, Electroporation을 이용해 hiPSC에 2종의 Cas9-sgRNA RNP 복합체를 치환하고자 하는 SNP 염기와 99 nt의 짧은 homology arm으로 구성한
ssDNA 형태의 HDR template를 함께 도입하였다 (그림 3).
그림 3. sgRNA와 HDR template 디자인
2. Analysis and characterization
유전자 편집 후,
SNP 검출 제품을 이용하여 두 sgRNA의 유전자 편집 효율을 비교하였다. 형광 값이 높을수록 타겟 위치에 SNP의 도입 효율이 높다는 것을 의미하며, hiPSC에서의 전체적인 유전자 편집 효율을 확인했을 때, sgRNA 1로 편집된 세포에서 원하는 SNP를 확인할 수 있었다 (그림 4).
그림 4. sgRNA 1, 2를 이용했을 때 유전자 편집 효율 확인
sgRNA 1을 이용해 편집된 세포에서 목적 SNP를 확인한 후, 세포를 single cell로 분리하여
DEF-CS™ single-cell cloning system을 이용해 확대 배양하였다. 배양 5일 후, 96 well에서 빠르고 정확하게 다수의 clone을 확인하기 위해
형광 기반 SNP 검출 제품을 이용하였으며, 각각의 세포주에서 c.786G>A SNP를 나타내는지 조사하였다. 형광 시그널을 통해 세포주의 약 19%에서 SNP 삽입이 잘 이루어졌음을 확인하였다.
그림 5. 형광을 통한 SNP 효율 확인 (*Nonclonal sample)
이 후, 편집된 세포주를 Sanger sequencing과 flow cytometry를 이용하여 특성 분석하였다. Sanger sequencing을 통해 세포주가 가지는 SNP가 homozygous한지, heterozygous한지를 확인하였으며, homozygous한 SNP를 가지는 세포들은 확대 배양한 후, flow cytometry에서 pluripotency marker인 Oct-4, TRA-1-60, SSEA-4의 발현을 확인하였다. 모든 배양 세포들은 세 마커 모두 높게 발현함으로써, 유전자 편집 후에도 pluripotency를 잘 유지하고 있음을 확인하였다 (그림 6).
그림 6. 편집된 세포주의 특성 분석
3. Differentiation of edited cells to hepatocytes
간질환인 Tyrosinemia를 연구하기 위해, 편집된 세포주 #181를
Cellartis®의 간세포 분화 kit를 이용하여 간세포로 분화했다. 22일간 분화한 후, 대조군과 편집된 hiPSC 유래 간세포 모두 전형적인 간세포 형태임을 확인했으며, 29일 째에 면역형광염색을 통해 92% 세포가 간세포 마커인 HNFα을 확인하였다.
그림 7. 편집된 hiPSC의 간세포 분화 및 효율 확인
간의 중요한 기능인 약물대사를 확인하기 위해, cytochrome P450 (CYP) family 대사에 관여하는 약물을 처리하였다. 분화 29일 째에 LC/MS를 이용하여 임상 약물 대사에 관여하는 CYP1A, CYP3A, CYP2C9, CYP2B6, CYP2D6 효소 활성을 측정하였으며, 대조군과 편집된 hiPSC 유래 간세포에서 80-90% 정도의 유사한 결과를 확인하였다.
그림 8. 편집된 hiPSC 유래 간세포에서의 CYP 효소 활성 확인
[원문] Introducing a tyrosinemia-related SNP in hiPS cells
