다카라에서는 AAV를 helper virus없이 안전하게 제작하기 위한 AAVpro
® Helper Free System과 함께 AAVpro
® CRISPR/Cas9, Tet-One 시스템 등 다양한 AAV 시스템을 제공하고 있다. 또한, AAV의 역가 향상을 위한 전용 transfection 시약과 packaging cell line, packaging cell line으로부터 AAV를 효율적으로 추출하기 위한 AAVpro
® Extraction Solution, 고순도 AAV 정제를 위한 AAVpro
® Purification Kit (All serotype, AAV2), 빠르고 간편하게 AAV의 역가 측정을 위한 Real Time PCR 방식의 AAVpro
® Titration Kit 등 AAV 실험에 필요한 다양한 제품을 공급하고 있다.
이러한 다카라의 AAVpro
® 제품을 이용하면, 효율적인 transduction을 위한 고역가의 AAV를 생산, 추출, 정제 및 titration 하여, 동물 세포나 각각의 동물 개체에 유전자 도입 (
in vivo transduction)할 수 있다.
[그림 1] AAV workflow
0. Overview
AAV (Adeno-associated virus)란?
Adeno-associated virus (AAV)는 면역원성이 낮고, 세포와 조직에 대해 유전자 도입 효율이 높아, 유전자 도입의 도구 또는 유전자 치료의 도구로 사용되며, Adenovirus, Retrovirus, Lentivirus보다 안전하다고 알려져 있다. AAV는 분열세포와 비분열세포에 대해 모두 감염 가능하며, 특히, 비분열세포에서는 장기간 유전자발현이 가능하다는 것이 특징이다.
AAV의 구조적 특징
Adeno-Associated Virus (AAV)는 Parvovirus 과의 Dependovirus 속에 포함되는 non-envelope virus이다. AAV의 genome은 약 4.7kb의 선형 single-strand DNA로, AAV genome의 양 말단에는 inverted terminal repeats (ITRs)로 불리는 hairpin 구조가 존재한다. ITR은 AAV genome의 복제와 AAV particle의 packaging에 관여한다.
AAV는 사람에게는 면역원성이 없는 것으로 알려져 있으며, adenovirus 또는 herpesvirus와 같은 helper virus 존재시에만 증식이 가능하다. Capsid protein에 따라 다양한 serotype (혈청형)이 존재하며, 이로 인해 조직 혹은 세포를 감염시키는 바이러스의 능력 및 조직 특이성이 다르게 나타난다.
Serotype에 따른 AAV의 조직 감염 특이성
AAV는 100개 이상의 serotype이 존재하며, serotype에 따라 종과 조직에 대한 감염 특이성 및 특징이 다르다. 다카라바이오는 AAV 연구에 가장 일반적으로 사용되는 6개의 serotype (AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9)에 대한 제품을 제공하고 있다. AAV2는 AAV를 활용한 연구 (예; 유전자 치료제)에 가장 많이 사용되며 다양한 종과 조직에 대해 감염능력을 가지는 특징이 있고, AAV1, AAV5, AAV6은 각 조직 별 감염 특이성을 가지고 있다. 또한 최근에는 AAV8과 AAV9를 이용한 연구가 늘고 있다(표 1. 참조).
[표 1] Serotype에 따른 AAV의 조직 감염 특이성
AAV serotype |
Origin |
Tissue tropism |
Approved drugs |
AAV1 |
Monkey |
근육, 중추신경계, 심장 |
|
AAV2 |
Human |
간, 중추신경계, 근육 |
Luxturna (2017)
(유전적 망막질환을 위한 in-vivo 유전자 치료제) |
AAV5 |
Human |
중추신경계, 폐, 눈 |
|
AAV6 |
Human |
근육, 중추신경계, 심장, 폐 |
|
AAV8 |
Human |
간, 근육, 중추신경계 |
|
AAV9 |
Human |
중추신경계, 심장, 간, 근육 |
|
* [References] Li, Chengwen, and R. Jude Samulski. "Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy."
Nature Reviews Genetics 21.4 (2020): 255-272.
※ 유전자 도입효율은 각 실험조건에 따라 달라질 수 있으므로 관련문헌을 참조하기 바랍니다.
1. Virus packaging
AAV packaging system
Adeno-associated virus (AAV)는 면역원성이 낮고, 세포와 조직에 대해 유전자 도입 효율이 높아, 유전자 도입의 도구 또는 유전자 치료의 도구로 사용되며, Adenovirus, Retrovirus, Lentivirus보다 안전하다고 알려져 있다. AAV는 분열세포와 비분열세포에 대해 모두 감염 가능하며, 특히, 비분열세포에서는 장기간 유전자발현이 가능하다는 것이 특징이다.
AAVpro® Helper Free System (AAV1, AAV2, AAV5, AAV6) (Code 6230 외)
- Helper virus를 사용하지 않고, 안전하게 AAV1, 2, 5, 6 제작 (Helper Free System)
- 독자적인 AAV extraction solution을 포함하고 있어, freeze/thaw 없이 간편하게 AAV 추출
- 구성
(1) Expression vector (pAAV-CMV vector)
(2) pRC vector (각 serotype 별 Cap 유전자 포함)
(3) pHelper vector
(4) AAV Extraction Solution A / B
- 다양한 application 제공 - CRE recombinase, LacZ, Tet-inducible, CRISPR/Cas9 system
- shRNA 발현용 - AAVpro® 2xU6 / U6-ZsGreen1 System
AAV packaging cell line
Transfection reagent for AAV packaging
2. Virus extraction and purification
3. Virus titration
