Cloning을 위한 많은 단계, 처음이라면 누구나 어렵습니다.
단계 단계 차근히 나아간다면, 당신도 Cloning 고수가 될 수 있습니다.

Cloning 이란?

Plasmid (vector) 라는 매개체를 이용하여 원하는 유전자 (insert) 를 많은 수로 증폭시키기 위한 분자생물학 실험기법으로, 목적유전자를 임의의 vector에 삽입하고 증폭하는 일련의 과정을 cloning이라고 지칭합니다. Cloning 실험은 유전자공학실험의 기초 기술 중 하나로 제한효소가 발견되고 분자생물학 실험에 응용됨에 따라 범용성이 높은 기술로 널리 이용되어 왔으며, 근래에는 제한효소 처리없이 진행하는 cloning 방법 (TA cloning, PCR cloning 등)으로 활용을 넓혀가고 있습니다.
Cloning에 이용할 insert DNA는 샘플로부터 genomic DNA 추출·정제하거나, RNA를 정제 후 역전사반응을 통해 cDNA를 합성, 또는 PCR에 의해 DNA 단편을 증폭하는 방법 등으로 확보할 수 있습니다. 간혹 insert DNA와 vector간의 제한효소 부위가 맞지 않는 경우, PCR primer에 제한효소 사이트를 추가하여 디자인한 후, insert DNA를 PCR 증폭하여 cloning에 필요한 제한효소 사이트를 insert DNA에 덧붙이는 방법을 사용하기도 합니다.

본 Cloning 가이드에서는 가장 널리 사용하는 방법 중에 하나인 (1) TA cloning과 (2) 제한효소 및 ligation을 이용한 cloning 과정을 TA cloning을 통해 확보된 clone에서 제한효소 처리를 통해 insert를 분리하여 최종 목적 vector로 옮기는 예시로 들어 실험과정을 소개하고자 합니다.

[Cloning Workflow]

TA-cloning과 제한효소를 이용한 cloning

일반적인 Cloning은 insert DNA와 vector를 같은 종류의 제한효소로 자르고 정제한 후, ligase 등을 통해 연결해주는 과정으로 진행합니다. 이 때 vector의 MCS 에서 적절한 제한효소 (insert DNA를 절단하지 않는 제한효소)를 선택하며, 적절한 제한효소 자리가 없는 경우 insert DNA의 PCR을 위한 primer를 디자인할 때 선택한 제한효소 서열을 추가하여 줌으로써 insert DNA 양 말단에 제한효소 사이트를 생성할 수 있습니다.
하지만 PCR을 통해 부가된 제한효소 사이트는 DNA의 양 말단에 존재하므로 제한효소 처리시 절단 효율이 떨어질 수 있고, insert DNA의 제한효소 처리/agarose gel 정제 등을 거치기 위해 초기에 많은 양의 DNA를 확보해야 하는 불편함이 발생할 수 있습니다. 많은 양의 PCR 산물을 확보하기 위해 PCR 증폭 사이클을 늘리기도 하지만, 이 경우 insert DNA 서열에 PCR 증폭 에러가 발생할 확률도 함께 높아지므로, 정확한 서열의 insert DNA를 확보해야 하는 cloning 실험에 추천하지 않습니다.
따라서 PCR로 생성된 insert DNA의 염기서열을 확인 (sequencing)하고, 정확한 서열을 가진 insert DNA를 다수 확보할 수 있도록 PCR 산물을 바로 TA-cloning 하는 방법을 이용할 수 있습니다.
TA-cloning을 통해 insert DNA가 포함된 plasmid를 확보하면, circular 형태의 plasmid를 얻을 수 있으므로, 제한효소 절단시 보다 효율이 높고, 정확한 제한효소 사이트를 가진 insert DNA를 확보할 수 있어 최종 목적 vector에의 cloning 효율도 높일 수 있는 장점이 있습니다.
아래에는 High Fidelity PCR 효소를 이용하여 insert DNA를 증폭한 후 TA-cloning을 거쳐 최종 목적 vector에 sub-cloning하는 과정을 소개합니다.

    - TA-cloning과 제한효소를 이용한 cloning (클릭하여 내용을 확인하세요)
       1. Insert DNA (목적유전자) PCR
           - PCR의 정확도와 PCR산물 말단에 대하여
       2. PCR 산물 정제
       3. PCR 증폭산물의 TA cloning
       4. E. coli 형질전환 (transformation)
       5. Insert 확인

★ PCR 효소의 Fidelity (정확도) 와 PCR 산물 말단에 대하여

제한효소 처리 후 발현용 vector로의 sub-cloning

일반적으로 TA-cloning을 통해 확보한 recombinant clone은 sequencing 후에, 최종 목적하는 vector로 목적유전자 (insert)를 옮기는 과정을 진행하게 됩니다.
실험목적, 유전자를 발현시키고자 하는 생물종에 따라 다양한 vector를 선택할 수 있습니다.

• 다양한 viral delivery system : Lentivirus, Adeno-associated virus(AAV), Retrovirus, Adenovirus - 바로가기
• CRISPR/Cas9 genome editing system : Plasmdi, virus, single-cell cloning 시스템 - 바로가기
• 식물발현용 binary vector : Agrobacterium 매개 식물형질전환용 vector 등 - 바로가기
• E. coli protein expression vector : cold shock vector, Chaperone 발현 C.cell 등 - 바로가기

여기서는 1) Adeno-associated virus system (AAV2)을 위한 AAV vector의 sub-cloning 과 2) 식물형질전환을 위한 binary vector로의 sub-cloning을 예시로 소개합니다.

   - 제한효소 처리 후 발현용 vector로의 sub-cloning (클릭하여 내용을 확인하세요)
       1. Expression vector 또는 최종 목적 vector 및 insert DNA 준비
       2. Ligation 및 E. coli 형질전환 (transformation)
       3. Insert 확인

★ 제한효소 처리, 어렵지 않아요!
★ 궁금해요~ 탈인산화효소 (Alkaline Phosphatase)

Cloning - FAQs

Q1. Ligation이나 형질전환 효율이 떨어졌을 때에 변경할 수 있는 과정은 무엇입니까?
A1. 다음의 조건 검토를 추천합니다.

• Ligation 반응 시간을 늘려줍니다.
• DNA 용액내에 염 (salt) 농도가 높으면 ligation 효율이 저하되며, 특히 에탄올 침전시 사용되는 ammonium acetate는 ligation 저해 작용을 하기 때문에, 에탄올 침전 시 염이 남지 않게 깨끗이 washing 하는 것이 중요합니다.
• DNA 추출 kit를 사용하는 경우, 추출액을 에탄올로 침전하고 버퍼를 교환하면 ligation 효율을 높일 수 있습니다.
• 돌출말단 (cohensive end) ligation의 경우 DNA 용액 (vector+insert DNA)을 60~65℃에서 2~3 분 정도 incubation 후, 바로 차갑게 유지한 상태에서 ligation 시약을 첨가하여 반응을 하면, ligation에 효율적인 돌출말단이 확보되어 ligation 효율을 높일 수 있습니다.

위의 실험으로 ligation 효율이 개선되지 않을 경우에는 DNA 정제를 다시 진행하는 것을 권장합니다.

Q2. 긴 단편의 cloning시 유의할 점은 무엇입니까?
A2. 길이가 긴 단편의 ligation은 효율이 저하되는 경향이 있습니다. TaKaRa DNA Ligation Kit LONG (Code 6024)은 긴 단편 ligation에 최적화되어 있어, 10 kb 이상의 ligation을 하는 경우에 적합합니다. 또한 Insert DNA를 포함한 plasmid의 전체 길이가 큰 경우 (특히, 10 kb를 넘는 경우)에는 대장균으로의 도입 효율이 낮아지고, 대장균 내에서의 plasmid 안정성도 떨어지므로, 정확한 clone을 확보하기 어려워집니다. 이러한 경우 큰 사이즈의 DNA를 효율적으로 형질전환할 수 있는 E. coli HST08 Premium Competent Cells(Code 9128)의 사용을 권장합니다.

Cloning 관련 제품 리스트

최고 정확도, Cloning용 PCR 효소 - PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase Ver.2
Colony PCR용 premix - EmeraldAmp^® GT PCR Master Mix
고효율의 Ligation premix - DNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞
Mighty TA-cloning Kit - Mighty TA-cloning Kit
Blunt end PCR 산물의 TA cloning에 최적 - Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR^®
다양한 탈인산화효소 - Alkaline Phosphatase (Calf intestine) / Alkaline Phosphatase (E. coli C75)
고효율 Competent Cell - E. coli Competent Cells/ E. coli Electro-Cells
최고의 Colony 형성능과 정확한 PCR cloning- In-Fusion^® Snap Assembly Master Mix