(1) Clean bench에서 RetroNectin solution을 녹인 후 잘 섞어줍니다 (Vortexing 하지 마세요.). Plate 코팅을 위해, 멸균 PBS를 이용하여 RetroNectin을 적절한 농도 (20~100 ㎍/㎖)^*1로 희석합니다.
^{*1 RetroNectin이 filter에 결합될 수 있으므로, RetroNectin 희석액을 여과하지 마세요.}

(2) RetroNectin 희석액을 plate^*2에 0.25~0.5 ㎖/㎠이 되도록 첨가하고 (plate 바닥이 잠기는 정도), 상온에서 2시간 또는 4℃에서 overnight 코팅합니다 (24-well plate는 well 당 0.5 ㎖, 6-well plate에는 well 당 2 ㎖의 RetroNectin 희석액을 첨가합니다.).
^{*2 반드시 코팅이 되지 않은 plate를 사용합니다.}

(3) RetroNectin 희석액을 제거하고, 2% BSA/PBS를 첨가하여 실온에서 30분간^*3 blocking을 진행합니다 (24-well plate에는 well당 0.5 ㎖, 6-well plate에는 well 당 2 ㎖ 첨가합니다).
^{*3 즉시 사용할 경우 blocking 과정을 생략하고, (4)의 PBS 또는 HBSS/Hepes로 washing을 2회 진행합니다.}

(4) 2% BSA/PBS를 제거하고, 적당한 양의 PBS 또는 HBSS/Hepes로 1회 washing 하면 RetroNectin 코팅plate^*4가 완성됩니다.
^{*4 2% BSA/PBS로 blocking한 경우, parafilm으로 밀봉하고, 밀봉된 RetroNectin 코팅 plate는 4℃에서 1주일간 보관 가능합니다.}

(1) 목적 유전자가 재조합된 Lenti/Retrovirus의 원액 또는 희석액을 RetroNectin 코팅 plate에 125~250 ㎕/㎠으로 첨가 후, virus particle과 RetroNectin의 결합을 위해 32~37℃, 5% CO₂ 조건에서 4~6시간 동안 배양합니다.

(2) RetroNectin 코팅 plate가 마르지 않도록 주의하며 virus solution을 제거하고, 그 즉시 적절한 양의 PBS 또는 0.1~2% albumin (BSA 또는 HSA)이 포함된 PBS를 첨가합니다 (첨가된 PBS는 target cell의 첨가 직전에 제거합니다).

(3) 부유 상태의 target cell을 준비합니다. Target cell의 크기 및 성장속도에 따라 적절한 양 (일반적으로 0.05~5x10⁵ cells/㎠)을 첨가합니다.

(4) Virus가 부착된 RetroNectin 코팅 plate에서 (2)에서 첨가한 PBS를 제거하고, 즉시 (3)에서 준비한 target cell을 첨가합니다.

Note : Target cell 첨가 후 centrifugation을 하면, target cell과 Lenti/Retrovirus의 접촉을 증가시킬 수 있습니다.

(5) 37℃, 5% CO₂ 조건에서 세포를 배양합니다.

Note: Multi-well plate를 사용하는 경우, well의 위치에 따라 유전자 도입 효율이 달라질 수 있습니다. 가능하면 plate의 가장 자리를 피해 중앙의 well을 사용하세요.

(1) 목적 유전자가 재조합된 Lenti/Retrovirus의 원액 또는 희석액을 RetroNectin 코팅 plate에 125~250 ㎕/㎠으로 첨가합니다.

(2) Virus particle과 RetroNectin의 결합을 위해 32℃, 2,000 x g로 2시간 동안 centrifugation합니다.

(3) RetroNectin 코팅 plate가 마르지 않도록 주의하며 virus solution을 제거하고, 그 즉시 적절한 양의 PBS 또는 0.1~2% albumin (BSA 또는 HSA)이 포함된 PBS를 첨가합니다 (첨가된 PBS는 target cell의 첨가 직전에 제거합니다).

(4) 부유 상태의 target cell을 준비합니다. Target cell의 크기 및 성장속도에 따라 적절한 양 (일반적으로 0.05~5x10⁵ cells/㎠)을 첨가합니다.

(5) Virus가 부착된 RetroNectin 코팅 plate에서 (3)에서 첨가한 PBS를 제거하고, 즉시 (4)에서 준비한 target cell을 첨가합니다.

Note : Target cell 첨가 후 centrifugation을 하면, target cell과 Lenti/Retrovirus의 접촉을 증가시킬 수 있습니다.

(6) 37℃, 5% CO₂ 조건에서 세포를 배양합니다

(1) 목적 유전자가 재조합된 Lenti/Retrovirus 원액 또는 희석액, target cell, culture medium을 섞습니다.
(2) (1)의 용액을 RetroNectin 코팅 plate에 0.25~1 ㎖/㎠으로 첨가합니다. Target cell의 크기 및 성장속도에 따라 적절한 양 (일반적으로 0.05~5x10⁵ cells/㎠)을 첨가합니다.
(3) 37℃, 5% CO₂ 조건에서 세포를 배양합니다.

(1) 목적 유전자가 재조합된 Lenti/Retrovirus 원액 또는 희석액, target cell, culture medium을 섞습니다.
(2) (1)의 용액을 RetroNectin 코팅 plate에 0.25~1 ㎖/㎠으로 첨가합니다. Target cell의 크기 및 성장속도에 따라 적절한 양 (일반적으로 0.05~5x10⁵ cells/㎠)을 첨가합니다.
(3) 25~37℃, 1,000 x g에서 30분간 centrifugation을 진행하여 virus particle과 target cell이 RetroNectin과 결합하도록 합니다.
(4) 37℃, 5% CO₂ 조건에서 세포를 배양합니다.

배양 면적 362.5 cm2의 RetroNectin 코팅 bag을 이용한 경우



^*1 효율적인 RetroNectin의 코팅을 위해 culture bag은 테플론 소재를 권장합니다. 
^*2 RetroNectin 코팅 bag의 크기와 재질에 따라 회전 속도 및 배양 시간은 다를 수 있습니다.

RBV-LTS 법의 상세한 프로토콜은 아래 논문을 참조하세요.

An Efficient Large-Scale Retroviral Transduction Method Involving Preloading the Vector into a RetroNectin -Coated Bag with Low-Temperature Shaking.  Dodo K, Chono H, Saito N, Tanaka Y, Tahara K, Nukaya I and Mineno J. PLoS ONE (2014 ) 9 (1) : e86275.