Yeast two-hybrid (Y2H) 기술은 새로운 protein-protein interaction 을 찾기 위해 주로 사용되고 있습니다. 1989년 Fields and Song^*1에 의해 발명된 이후, 최근까지 28,000 건 이상의 논문에서 거의 모든 생물학적 pathway 내의 interaction을 발견하는데 사용되고 있습니다.

^*1. Fields, S. and Song, O. (1989) Nature 340(6230):245-247

목적 protein ("bait" protein; 알고 있는 단백질로 직접 cloning)은 Yeast GAL4 protein의 DNA-binding domain (DNA-BD)과 융합되어 발현 후, 스스로 transcription을 활성화할 수 없으나 4개의 reporter 유전자의 상류에 위치한 GAL4-responsive promoter에 결합할 수 있습니다. 한편, 목적 protein ("bait" protein)과 상호작용 하는 partner protein ("prey" protein; 미지의 단백질로써 library 형태로 제공)은 Yeast GAL4의 transcriptional activation domain (AD)에 융합하여 transcription을 활성화시키는 역할을 합니다. 따라서 Prey protein이 bait protein과 상호작용할 때 GAL4 promotor의 activity가 회복되어 하나 또는 그 이상의 reporter protein이 활성화됩니다.

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Yeast는 살아있는 진핵세포 시스템으로 원핵세포인 박테리아만큼 사용이 쉽고 간편합니다. Yeast가 two-hybrid 숙주로 선호되는 여러 가지 중요한 이유가 있습니다.

1) Yeast에서 발현된 protein 은 3차 구조를 형성하고, neutral internal pH를 제공하며, disulfide bond와 일반적인 다른 진핵세포에서 일어나는 post-translational modification을 진행하기 때문입니다. 이는 원래의 protein구조를 유지하고 protein-protein interaction을 촉진하는 매우 중요한 기능을 합니다.
2) Yeast는 매우 쉽게 다룰 수 있고 genome 서열이 완벽하게 해석되어 있습니다.
3) Homologous recombination을 통해 yeast 내에서 직접, 매우 쉽게 library 를 구축할 수 있습니다.

최소 8 amino acids^*2부터 최대 750 amino acids^*3까지의 protein이 yeast two-hybrid로 성공적으로 분석되었다고 보고 되었습니다.
^*2. Heery, D. M. et al. (1997) Nature 387(6634):733-736.
^*3. Schaefer B. C., Ed. (1997) Gene Cloning and Analysis: Current Innovations, (HorizonScientific Press), pp11-28.

Aureobasidin A (AbA)은 S. cerevisiae에 대해 매우 강한 독성을 가진 항생제로써 Matchmaker Gold System은 이 항생제에 대하여 내성을 갖게 하는 매우 독특한 reporter인 AUR1-C 유전자를 지니고 있습니다. 매우 안정적인 antifungal depsipeptide에 대한 내성을 이용하면 선별 영양 배지만 사용할 때 필요했던 별도의 최적화 과정 없이도 간편하게 Y2H library screening에 이용할 수 있습니다.

가능합니다. 그러나 Yeast Two-hybrid 시스템은 일반적으로 Cytoplasmic domain의 상호작용에 대한 분석에는 한계가 있다고 알려져 있습니다. Matchmaker Gold reporter는 세포 핵 내에 위치하여 있으므로, 이를 검출하기 위해 Bait-Prey interaction이 핵 내에서 발생해야만 합니다. Target protein이 정확하게 folding하고 핵 내에 위치한다면 Prey protein과의 상호작용을 검출할 수 있습니다 (모든 Matchmaker vector 들은 bait, prey protein이 핵 내에 위치할 수 있도록 하는 시그널을 보유하고 있습니다). 또한 일반적으로 Bait의 signal peptide와 transmembrane domain을 제거하는 것을 권장합니다. Transmembrane protein에 대한 two-hybrid 시스템은 관련 논문을 참고해주세요.

• Hopkinson, S.B. & Jones, J. C. (2000) Mol. Biol. Cell. 11(1):277-286
• Traweger, A. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277(12):10201-10208
• Tian, X. Y. et al. (2001) Reproduction. 121(6):873-880
• Daniel, J. M. & Reynolds, A. B. (1999) Mol. Cell. Biol. 19(5):3614-3623.
• Rochdi, M. D. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(18):18981-18989.

Bait가 eukaryotic transcription factor라면 prey protein과 interaction 없이도 스스로 yeast reporters를 활성화 시킬 가능성이 있기 때문입니다.

아니오. X-Gal과 X-α-Gal은 동일하지 않습니다. X-Gal 은 E.coli 효소 β-galactosidase (lacZ)의 기질이지만 X-α-Gal은 yeast 효소 alpha-galactosidase (Mel1p)의 기질로 사용합니다. X-α-Gal 은 Matchamker Gold System에서 blue/white colony screening에 사용됩니다. Mel1p는 protein-protein interaction에 의해 MEL1 유전자를 활성화시키면 yeast에서 분비됩니다.

Mate & Plate library (Code 630468 외)는 MATα haploid yeast (Y187)에 transformation 후 분주하여 판매하는 Two-hybrid용 library입니다. Bait를 발현시키는데 사용하는 Y2H Gold와 AH109의 yeast MATa two-hybrid reporter strain 과 함께 mating할 수 있습니다. Y2H Gold bait를 SD/-Trp 배지에서 간단히 overnight 배양한 후, 다음날 library 중 1 개의 tube에서 잘 섞어 줍니다. 그런 다음 mating이 일어나도록 하룻밤 더 incubation 후, SD/-Leu/-Trp/X- α-Gal/AbA에 diploid cell을 도말하여 Y2H interaction이 일어난 colony들을 선별합니다.

다카라코리아에서는 Make Your Own “Mate & Plate” Library System (Code 630490)을 추천합니다. Yeast two-hybrid library를 만드는 데, 이보다 더 간단한 방법은 없으며 screening하는 가장 쉬운 방법입니다.

가능합니다. Make Your Own “Mate & Plate” Library System (Code 630490)은 SMART 기술을 이용하여 cDNA를 합성하기 때문에 매우 소량의 시료라 하더라도 가능합니다. 초기 100 ng의 total RNA로도 library를 제작할 수 있습니다.

다카라코리아에서는 다른 유래의 yeast two-hybrid library는 테스트하지 않았습니다. 그러나 이론상으로는 prey (library) vector가 LEU2 marker로 선별되는 library라면 Matchmaker gold에 적용할 수 있을 것으로 생각합니다.

Protein-protein interaction을 선별하기 위해 HIS3 nutritional reporter 만을 사용하는 일반적인 Yeast two-hybrid 시스템은 많은 수의 (i) background colony와 (ii) false positive를 생성합니다.
(i) Background colony는 nutritional reporter가 일부 발현이 되었거나 또는, 너무나 빽빽하게 plating되었을 경우 나타납니다.
(ii) false positives는 bait 와 독립적으로 prey protein이 reporters의 upstream 서열을 인식하여 결합하기 때문에 발생됩니다.
하지만 Matchmaker Gold System에서 사용하는 Aureobasidin A (Code 630466)은 새로운 yeast two-hybrid 항생제로써 저항성이 없는 모든 세포를 매우 효과적으로 죽이는 반면, 세포에 대한 높은 안정성을 지니고 있어 background colony가 거의 발생하지 않습니다. 추가적으로 Matchmaker Gold는 독립적으로 결합한 prey protein이 3 개의 recognition sequences에 결합해야 하고 4 종류의 reporters가 활성화되어야 하기 때문에 False positive colony의 생성 또한 최소화할 수 있습니다.

YPD (Code 630409)는 “Yeast Peptone Dextrose” 배지의 약자로 amino acids, salts, dextrose (glucose), 그리고 그 외 빠른 yeast 생육을 도와주는 영양 배지입니다. YPDA (Code 630464)는 YPD에서 120 ㎎/L adenine hemisulfate가 첨가된 배지로 ADE2 mutant allele를 가진 yeast strains이 pink 또는 red로 변하는 것을 방지합니다. Clontech의 YPDA 에는 adenine hemisulfate의 최종 농도가 표준 protocol에서 사용하는 농도 (40 ㎎/L)보다 3배 더 많이 포함되어있으므로 만약 다른 sources의 배지를 사용한다면 Matchmaker yeast strains은 pink 또는 red로 변할 가능성이 있습니다.

Yeast가 adenine의 함량이 적은 배지에서 자라는 경우, ADE2 또는 ADE1 strains 에서 축적된 purine 전구체 ADE2 mutants에 의해 적색 색소가 발생하여 축적됩니다. 다카라코리아는 적색 색소가 축적되는 것을 방지하기 위해 120 ㎎/L adenine hemisulfate가 들어간 배지인 YPDA에서 모든 yeast strains을 키울 것을 권장합니다. Red 색소는 특성이 잘 알려지지 않았지만, 몇몇 화학적 분석이 1967년에 발표되기도 했습니다. 색소는 vacuole에 축적되고 450-490 nm 파장에서 형광을 내는 것으로 보여집니다.

Agar를 정확한 양 (20 g/L)를 넣었다고 추정할 때, 실패의 원인은 과도한 autoclave와 낮은 pH 때문일 수 있습니다. 121℃에서 15 분간 autoclave하기 전 정제된 물이 산성인 경우, minimal SD 배지는 pH 5.8, YPDA는 pH6.5 로 맞춰야 합니다