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[Overview] In-Fusion® HD Cloning

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[Overview] In-Fusion® HD Cloning



1. In-Fusion® HD Cloning?
In-Fusion® HD Cloning은 ligation-independent cloning (LIC) 방법 중의 하나로써, In-Fusion® 효소를 이용해 DNA 단편 간의 상동서열 15 bp를 융합시켜 cloning하는 기술이다. Vector와 Insert의 양 말단 서열을 특이적으로 이용하기 때문에 어떠한 종류의 vector 및 insert도 자유롭게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 방향성 있는 cloning이 가능하다.

2. In-Fusion® HD Cloning의 특징

15년 이상 축적된
cloning 노하우

  • Fusion PCR Cloning의 원조 (Since 2002)
  • 연구자들이 직접 인정한 최고 효율의 PCR Cloning Kit

Any vector
Any insert
Any site

  • 제한효소 및 MCS site에 관계없이 원하는 위치에 cloning
  • Shuttle vector 불필요: Final expression vector (destination vector)에 바로 cloning
  • Large vector (cosmid: ~ 46 kb), Large insert (~ 15 kb) cloning 가능

빠르고 간편한 cloning

  • 15분의 빠른 Cloning 반응
  • Vector, Insert modification 불필요
    - A-tailing, Alkaline phosphatase, Restriction enzyme mapping 등 불필요
  • Directional cloning: Insert의 방향성 유지

탁월한 cloning 효율

  • 95% 이상의 positive clone (false positive 확률 낮음)
  • Multiple insert cloning도 높은 효율로 가능

다양한 적용*

  • Single insert cloning
  • Multiple insert cloning
  • sgRNA cloning for CRISPR/Cas9
  • Site-directed mutagenesis
  • High-throughput cloning
  • Vector modification (vector tagging 등)
* In-Fusion® HD Cloning의 다양한 적용사례를 확인하세요 (Applications Collection 바로가기 ☞)


3. In-Fusion® HD Cloning의 원리와 Flow Chart
① Amplify (Insert 및 vector 준비)
In-Fusion® 효소는 각 DNA 단편 말단의 15 bp 상동서열*을 인식해 서로 융합시킨다. 이는 linearized vector 양 말단의 15bp 서열을 insert에 PCR로 부가하는 간단한 방법을 이용하는데, insert PCR 증폭에 사용하는 PCR primer** 5’ 말단에 linearized vector의 말단서열과 동일한 15 bp 서열을 추가하는 것이 핵심이다.

    * Multiple insert cloning의 경우, 20 bp 상동서열을 권장
    **In-Fusion® PCR primer의 디자인은 온라인 툴을 이용하여 쉽고 간단하게 설계할 수 있다.

② In-Fusion® Reaction
In-Fusion® 효소는 Insert와 vector의 5’ 말단의 15 bp를 단일 가닥의 돌출부 (cohesive end)로 만들며, 이러한 단일가닥의 돌출부는 서로 융합 (fusion 또는 annealing)하게 된다. 그 후, Insert와 vector 사이에 발생한 nick은 E.coli competent cell에서 수복된다.

③ Transformation
In-Fusion® 반응 후의 산물을 E.coli competent cell에 transformation한다
(Transformation efficiency가 108 cfu/㎍ 미만인competent cell은 권장하지 않습니다).


그림 1. In-Fusion® HD Cloning의 Flowchart

4. In-Fusion® primer 디자인
① In-Fusion® primer 디자인 방법
In-Fusion® cloning을 위하여 linearized vector의 말단 15 bp 서열을 insert에 PCR로 부가한다. 이 때 사용하는 In-Fusion® PCR primer의 디자인 방법은 PCR primer의 5’ 말단에 linearized vector의 15 bp 서열을 추가하는 것이다 (그림 2). 이 때, 아래의 그림과 같이 linearized vector 말단 서열의 모양 (5’ 또는 3’ cohesive end, blunt end)에 맞춰서 In-Fusion® primer를 설계해야 하며, In-Fusion® Primer 디자인은 온라인 툴을 이용하여 간단하게 제작할 수 있다
(In-Fusion® Primer 온라인툴 바로가기)


그림 2. Insert PCR을 위한 In-Fusion® primer 디자인

② In-Fusion® primer 디자인 참고자료


5. In-Fusion® HD Cloning Kit 선택가이드
① In-Fusion® HD Cloning 시리즈 - Liquid Type (기본효소 타입)
  • 모든 제품에는 In-Fusion® HD Enzyme Premix, Positive control vector & insert가 포함

제품정보

추가 구성품

Code

제품명

용량

PCR 효소1)

정제 Kit2)

Comp.cells3)

639648

In-Fusion® HD Cloning Kit

10회

-

-

-

639642

In-Fusion® HD Cloning Kit w/Competent Cells

10회

-

-

O

639639

In-Fusion® HD Cloning Kit w/NucleoSpin®

10회

-

O (NS)

-

639633

In-Fusion® HD Cloning Kit w/Cloning Enhancer

10회

-

O (CE)

-

638909

In-Fusion® HD Cloning Plus

10회

O

O (NS)

O

638916

In-Fusion® HD Cloning Plus CE

10회

O

O (CE)

O

1) PCR 효소: CloneAmp HiFi PCR Premix (Code 639298)
2) 정제 Kit: NucleoSpin® Gel and PCR Clean-Up Kit (컬럼타입) 또는 Cloning Enhancer (Code 639613)
3) Comp.cells: Stellar™ Competent Cells (Code 636763)

② In-Fusion® HD Cloning 시리즈 - EcoDry™ Type (동결건조 효소 타입)
  • EcoDry™는 효소, buffer 등의 실험에 필요한 모든 시약이 동결건조 형태로 premix된 제품이며, 8-well strip tube에 분주 되어있어, 편리하게 이용할 수 있고 실험 간의 오차를 최소화할 수 있다
  • In-Fusion® HD EcoDry™ Type의 경우, In-Fusion® 반응 시간이 30분
  • 모든 제품에는 In-Fusion® HD EcoDry™ Enzyme Premix, Positive control vector & insert가 포함

제품정보

추가 구성품

Code

제품명

용량

PCR 효소1)

정제 Kit2)

Comp.cells3)

639689

In-Fusion® HD EcoDry™ Cloning Kit

8회

-

-

-

639678

In-Fusion® HD EcoDry™ Cloning Kit w/Competent Cells

8회

-

-

O

639687

In-Fusion® HD EcoDry™ Cloning Kit w/NucleoSpin

96회

-

O (NS)

-

638912

In-Fusion® HD EcoDry™ Cloning Plus

8회

O

O (NS)

O

1) PCR 효소: CloneAmp HiFi PCR Premix (Code 639298)
2) 정제 Kit: NucleoSpin® Gel and PCR Clean-Up Kit (컬럼타입) 또는 Cloning Enhancer (Code 639613)
3) Comp.cells: Stellar™ Competent Cells (Code 636763)

③ In-Fusion® HD Cloning 성공률 향상을 위한 필수품

 

Code

제품명

용량

특징

PCR 효소1)

639298

CloneAmp HiFi PCR Premix

200회

정확한 Cloning을 위한 High-fidelity PCR 효소

정제 Kit2)

639613

Cloning Enhancer

25회

Insert PCR 반응 후, 잔여물 제거

Comp.cells3)

636763

Stellar™ Competent Cells

10회

고효율 Transformation Comp.cells
(> 5 × 108 cfu/μg pUC19)

636764

Stellar™ Competent Cells (dam-/dcm-)

10회

636765

Stellar™ Electrocompetent Cells

10회



6. In-Fusion® HD Cloning 참고 자료