Initial denaturation step
Preheating 과정은 간혹 복잡한 주형 (예, genomic DNA)의 denaturation에 필요하며, 94℃, 1분이면 충분합니다. 필요 이상의 heating 과정은 효소의 성능 저하를 야기할 수 있습니다.

• 샘플의 정제과정이 필요 없는 direct PCR을 위한 MightyAmp™ DNA Polymerase Ver.3는 98℃, 2분의 preheating 과정을 반드시 진행합니다.
• 긴 단편의 DNA 증폭에 적합한 TaKaRa LA Taq^®, Advantage GC 2 Polymerase는 initial denaturation 과정이 필요합니다.
• PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase 를 포함한 PrimeSTAR^® 시리즈는 효소 활성화를 위한 preheating 과정이 필요하지 않습니다.

Denaturing conditions
Denaturation 조건은 사용중인 PCR 기기 모델에 의해 결정되며, 일반적으로 94~95℃, 30초 또는 98℃, 10초로 진행합니다.
만약 PrimeSTAR^® 시리즈와 같이 heat-resistant enzyme이라면, 높은 온도, 짧은 시간의 denaturation 과정을 추천합니다 (예, 98℃, 5~10초). Denaturation 온도가 너무 높거나, 오랜 시간 반응하면 효소 활성이 저하되고, 길이가 긴 주형이 손상될 수 있습니다.

Annealing conditions
Annealing 조건은 각 primer set에 따라 다르며, annealing 온도는 primer의 Tm값에 따라 결정합니다. 너무 낮은 annealing 온도를 사용하면 mispriming 이나 비특이적인 증폭이 발생하고, 목적산물의 수율이 낮아질 수 있습니다.
Primer의 Tm값에 따라 annealing 온도를 조정하거나 2 step PCR로 증폭효율과 특이성을 높일 수 있습니다.

• Taq 계열 효소의 annealing 시간은 30초를 추천합니다.
• PrimeSTAR^® 시리즈는 priming 효율이 매우 높으므로 5 ~ 15초의 짧은 annealing 시간을 추천하며, 길 경우 mispriming에 의한 비특이적인 증폭이 발생할 수 있습니다.
• 1 kb보다 짧은 단편을 증폭할 때는 3 step PCR을 추천합니다.

GC-rich 타겟이나 증폭사이즈가 큰 경우 (>10 kb)에는 2 step PCR을 추천합니다.

Extension step
일반적으로 extension 시간은 1분/kb로 추천합니다. SpeedSTAR™ HS DNA Polymerase 또는 SapphireAmp^® Fast PCR Master Mix 와 같은 고속 PCR용 효소는 보통 10초/kb의 extension 시간을 셋팅합니다. (예, 1 kb 산물 증폭시 10초, 2 bk 산물 증폭시 20초)
PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase 또는 PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase는 특별한 elongation factor를 포함하고 있어 5~20초/kb의 빠른 속도로 증폭할 수 있지만, 주형양이 많은 경우 반드시 1분/kb의 기본조건으로 PCR을 진행해야 합니다.

3 step PCR은 denaturation-annealing-extension 과정으로 진행되고, primer의 Tm값이 extension 온도보다 낮거나 68℃ 보다 낮은 경우에는 3 step PCR 조건을 사용해야 합니다.
Primer의 Tm값이 extension 온도 (72℃)에 가깝거나 낮다면, denaturation 후, annealing과 extension이 한 단계로 진행되는 2 step PCR을 고려하며, 이 조건을 이용할 경우, annealing 온도가 extension 온도를 넘지 않도록 조건을 설정합니다.

extension 온도 68℃ 는 2 step PCR 또는 증폭산물이 길 때 (> 4kb) 주로 사용합니다. 낮은 extension 온도는 증폭에 영향을 줄 수 있는 depurination 확률을 낮춰 긴 단편의 증폭수율을 크게 개선시킬 수 있습니다.
72℃는 3 step standard PCR이나 짧은 단편 (< 4kb) 증폭 시 주로 사용합니다.

PCR에 사용되는 주형 DNA의 적정량은 주형의 구조 (복잡성), 타겟 서열의 copy number 등에 따라 달라질 수 있습니다. 25~30 cycle의 PCR을 진행한다면, 증폭산물을 검출하기 위해 약 10⁴ copy의 DNA 서열을 필요로 합니다.

• 일반적으로 1 ㎍의 인간 genomic DNA는 3.04 x 10⁵ 분자의 DNA를 포함합니다. 대부분의 PCR 적용은 30~100 ng의 인간 genomic DNA면 충분하며, house keeping gene과 같이 카피수가 많은 유전자가 타겟인 경우, 10 ng 으로도 충분합니다. 복잡한 구조의 주형은 10 ng ~ 500 ng의 DNA를 사용하는 것을 추천합니다.
• 일반적으로 1 ㎍의 E. coli genomic DNA는 2 x 10⁸ 분자의 DNA를 포함하며 100 pg ~ 1 ng을 사용하는 것을 권장합니다.
• 일반적으로 1 ㎍의 λ genomic DNA는 1.9 x 10¹⁰ 분자의 DNA를 포함하며 최소 100 pg을 사용할 수 있습니다.
• cDNA를 주형으로 사용하는 경우 타겟의 copy 수에 따라 사용량이 달라지며, RT 반응에 사용한 RNA 양으로 대신 검토할 수 있으므로 최소 10 pg (RNA 해당량)을 PCR에 사용합니다.

모든 PCR polymerase가 과도한 양의 주형을 대상으로 한 PCR 증폭에 효율적으로 적용되는 것은 아닙니다. 따라서, 1 ㎍ 이상 과량의 주형을 PCR 증폭한다면 PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase를 추천합니다.

주형 DNA의 quality
온전한 상태의 DNA (DNA integrity)가 긴 타겟의 증폭에 가장 중요한 조건입니다. DNA 정제과정에서 발생하는 DNA 분해 또는 높은 온도와 낮은 pH 조건에서 유발되는 DNA depurination 등과 같은 DNA 손상은 결국 단편적인 증폭산물을 증가시키고, 전체 증폭산물을 감소시킵니다.
DNA 손상은 산성화된 조건에서도 발생할 수 있으므로, DNA 주형을 물에 녹이는 것은 좋지 않습니다. DNA는 pH 7~8 또는 buffer solution에서 가장 안정적입니다.

PCR 조건

• Denaturation 시간은 최소화하여 depurination 발생을 줄입니다.
• Touchdown PCR로 높은 annealing 온도에서 반응을 시작하여 그 후 몇 사이클 동안은 사이클 당 2도씩 온도를 내리면서 증폭합니다.
• Primer Tm값을 68℃ 이상으로 디자인합니다.

PCR Polymerase
Takara에서는 long range PCR에 최적화된 TaKaRa LA Taq^® DNA Polymerase와 GC 함량과 타겟 사이즈에 따라 TaKaRa LA Taq^® with GC Buffer, PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase 제품을 판매하고 있습니다.

Genome에 따라 GC 비율은 다릅니다. 보통 주형의 GC 함량이 >65% 일때 GC rich 하다고 볼 수 있습니다. Genome 상에서 GC-rich 영역은 대부분 promoter, enhancer, cis-regulatory element 등의 조절영역에 집중 분포되어 있습니다. GC-rich 영역은 inverted repeat, hairpin 구조를 형성하는 경향이 있어, PCR의 annealing 과정에서 두 가닥이 충분히 분리되지 않을 수 있습니다. 이 경우, 불완전하게 분리된 두 DNA 가닥으로 인해 GC-rich 서열의 증폭이 방해될 수 있고, polymerase의 합성이 중간에 멈춰 불완전한 형태의 증폭산물이 발생하게 됩니다.

PCR 조건

• 주형 DNA의 완전한 denaturation을 위해 높은 denaturation 온도에서 PCR을 진행합니다.
  (94℃, 95℃ 보다 98℃ 추천)
• Annealing 시간은 가능한 한 짧게 설정합니다.
• 높은 온도에서 annealing이 진행될 수 있으므로, Tm값이 더 높은 (> 68℃) primer를 사용합니다.

PCR 효소
GC-rich 서열의 증폭에 최적화되어 있는 PCR 효소를 사용합니다. Takara에서는 GC-rich 서열의 증폭에 적합한 TaKaRa LA Taq^® with GC Buffer, PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase, Advantage GC 2 Polymerase Mix 등의 PCR 효소를 판매하고 있습니다.

PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase, CloneAmp™ HiFi PCR Premix를 이용하는 고객으로부터 DMSO를 첨가하여 GC-rich 서열의 증폭을 개선했다는 피드백을 받은 적이 있습니다. 권장하는 DMSO 농도는 2.5% ~ 5%입니다.

어떤 주형은 일반적인 PCR 조건으로 증폭하기 어려운 긴 AT-rich 영역을 가지고 있기도 합니다. Plasmodium falciparum genome은 약 80%가 AT 염기로, flanking region 영역에 AT-rich 서열이 존재하는 것으로 알려져 있습니다.
GC-rich 서열의 증폭에 추천하는 EmeraldAmp^® GT PCR Master Mix, PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase등이 AT-rich 서열의 증폭에도 적합합니다.
AT-rich 서열은 좀 더 낮은 extension 온도에서 증폭할 수 있다는 장점이 있습니다. AT 서열이 80 ~ 85% 이상인 특정 주형의 경우 extension 온도를 72℃에서 65 ~ 60℃로 낮출 수 있고, 낮은 온도로 인해 DNA 복제가 더 잘 되는 것이 확인된 바 있습니다 (Su et al. 1996).

References
Su, X. Z., et al. Reduced Extension Temperatures Required for PCR Amplification of Extremely A+T-rich DNA. Nucl Acids Res. 24, 1574-1575 (1996).

마그네슘 이온 (Mg²⁺)은 내열성 DNA polymerase의 조효소(cofactor)로 작용하며 원활한 증폭반응을 위해 매우 중요한 요소입니다. 적정 농도의 유리 Mg²⁺ 가 없으면 PCR 효소는 활성화되지 않고, 반대로 과량의 유리 Mg²⁺은 효소의 정확도 (fidelity)를 낮춰 비특이적인 증폭을 유발할 수 있습니다. 주형 DNA의 농도, 샘플에 포함된 chelating 시약 (예, EDTA, 구연산염 등), dNTP 농도와 단백질 유무 등 다양한 요소가 유리 Mg²⁺ 농도에 영향을 줄 수 있습니다.

• TaKaRa Ex Taq^®, TaKaRa LA Taq^® 등의 효소는 원하는 조건으로 Mg²⁺ 농도를 조정할 수 있도록, 마그네슘이 포함되어 있지 않은 (Mg²⁺ free) buffer 와 별도의 25 mM MgCl₂ 를 제공하는 제품라인을 갖추고 있습니다.
• Titanium^® Taq DNA Polymerase, Advantage^® 2 DNA Polymerase는 마그네슘 이온에 강한 (tolerant) 효소로 3.5 mM의 MgCl₂를 포함하는 buffer가 함께 제공됩니다.
• PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase와 PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase 이용시 Mg²⁺ 최종농도는 1mM이며, 해당 농도에서 높은 정확도로 PCR을 진행할 수 있습니다.

성공적인 PCR을 위해 denaturation 과정에 DNA duplex가 분리되고, primer가 그 분리된 DNA에 결합하는 것이 필요합니다. 염은 DNA phosphate backbone 상의 음전하를 중화시켜 분리된 단일가닥의 DNA가 서로 밀어내는 것을 상쇄하여 DNA를 안정화시키는 역할을 합니다. 염화칼륨 (Potassium chloride, KCl)은 PCR 증폭에 사용되는 대표적인 염으로 최종농도 50 mM로 사용합니다. DNA 단편의 증폭효율을 높이기 위해, 특히 100~1,000bp 사이즈의 증폭 시 KCl 농도를 70 ~ 100 mM로 높이는 것을 추천합니다. 좀 더 긴 사이즈의 증폭에는 낮은 염농도의 조건이 더 효율적인 반면 짧은 길이의 증폭에는 더 높은 염농도가 적합합니다. 이는 높은 염농도로 인해 긴 DNA 분자보다 짧은 DNA 분자의 denaturation이 우선적으로 일어나기 때문이라고 알려져 있습니다.
단, 50 mM 이상의 염 농도는 Taq polymerase의 활성을 억제할 수 있어 주의가 필요합니다.