hematopoietic cell의 transduction 효율 향상
RetroNectin® reagent
- Co-localization향상 : 바이러스와 hematopoietic cell을 밀착시킴
- Transduction 효율 증가 : 바이러스와 세포의 co-localization 향상으로 polybrene을 사용하는 기존의 프로토콜보다 hematopoietic cell에서 transduction 효율을 높임
■ Introduction
Hematopoietic stem cell (HSC)과 terminally differentiated cell (e.g., primary T cell, 대식세포)을 포함한 대부분의 hematopoietic cell은 바이러스를 이용한 유전자 전달 효율이 낮기 때문에 hematopoietic diseases의 유전자 치료 연구에 큰 장애물이 된다.
Hematopoietic cell의 lentivirus 및 retrovirus 감염 효율은 타겟 세포의 cell cycle과 표면에 발현하는 수용체 등의 다양한 요인에 의해 많은 영향을 받는다. 때문에 바이러스가 세포에 잘 붙고 도입할 수 있게 하는 방법으로 hematopoietic cell의 transduction 과정에서 보조인자를 추가하는 것이 일반적이다. Cationic polymers (e.g., Polybrene), cationic lipids (e.g., Lipofectin이나 Lipofectamine), cationic peptides (e.g., protamine)이 transduction enhancer로 주로 사용되어 막 전하를 중화하거나 바이러스 응집을 촉진한다. 그러나 이러한 많은 첨가제들은 강한 세포 독성을 일으켜 cell viability와 proliferation에 부정적인 영향을 줄 수 있다.
■ Results
Enhanced virus-cell co-localization
RetroNectin
® polypeptide는 human fibronectin 단백질에서 유래한 3 개의 기능적 도메인으로 구성되어 있고, 바이러스와 hematopoietic cell의 co-localization을 촉진하여 transduction 효율을 향상시킨다. 바이러스는 헤파린 결합 도메인의 상호작용을 통해 RetroNectin
® peptide에 결합한다. 또한 hematopoietic cell은 표면에 있는 인테그린 수용체인 VLA-4와 RetroNectin
® 의 CS-1도메인과 상호작용하면서 결합하게 된다.
RetroNectin
®이 transduction효율을 높이는 것으로 추정되는 메커니즘은 세포가 세포 표면 수용체를 통해 RetroNectin
® 분자와 상호작용하고, Lentiviral 또는 Retrovirus가 RetroNectin
®의 H-도메인에 결합하여 일어난다. 이러한 상호작용은 세포와 바이러스의 국소적인 농도를 증가시키면서 더 많은 유전자를 도입할 수 있도록 한다.
>> RetroNectin® 작용에 대해 더 자세히 보기
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High-efficiency transduction of hematopoietic cells
RetroNectin
®은 세포와 바이러스 입자의 물리적 거리를 근접하게 함으로써 다양한 hematopoietic cell 타입으로의 바이러스 매개 유전자 전달을 향상시킬 수 있다.
Hematopoietic cell으로의 유전자 전달 효율1 |
Cell type |
Efficiency (%) |
Human CD34+ CD38- BMC2 |
95.5 |
Human PBMC3 |
91.2 |
TF-1 |
97.9 |
SupT1 |
97.3 |
Jurkat |
80.1 |
K-562 |
90.4 |
HL-60 |
86.1 |
Monkey CD34+ BMC |
72.0 |
Monkey CD4+ T-cell |
85.0 |
1 유전자 전달 효율은
RetroNectin® Recombinant Human Fibronectin Fragment (T100A) 사용자 매뉴얼에 기재된대로 RetroNectin-Bound Virus (RBV) 방법에 의해 수행되었다.
2 Bone marrow cells
3 Peripheral blood mononuclear cells
Improved transduction compared with conventional methods
Polybrene과 같은 기존 방법에 비해, RetroNectin
®은 감염이 어려운 세포 타입 (e.g., hematopoietic cells)에도 retrovirus과 lentivirus의 transduction 효율이 높다. RetroNectin
®은 human CD34+ cells에서 transduction 효율을 50-70%까지 증가시킬 수 있다 (그림1). RetroNectin
®을 사용했을 때 transduction 효율을 높일 뿐 아니라, 사실상 세포독성이 나타나지 않았다.
그림1. RetroNectin®과 Polybrene을 처리하여 human HSC에서의 retroviral transduction을 비교하였다.
Polybrene 및 RetroNectin
®을 사용하여 유전자 전달 효율을 비교하기 위해 GFP를 human CD34+ HSCs로 도입하였다. Transduction 후, flow cytometry으로 형광을 측정하였다. GFP 발현은 히스토그램의 X-축에 표시하였고, GFP를 발현하는 CD34+ cell의 백분율을 plot에 표시하였다. 그 결과 polybrene을 사용했을 때보다 RetroNectin
®을 사용했을 때 transduction 효율이 86 배 (각각 25.8% 및 0.3%)나 더 높았다.
■ Conclusions
Hematopoietic cell을 이용한 연구는 유전자 전달 효율이 낮아서 제한되는 경우가 많다. 이때 RetroNectin
®을 사용하면 lentivirus 및 retrovirus와 hematopoietic cell의 co-localization을 촉진하여 transduction 효율을 효과적으로 향상시킬 수 있다.
■ Methods
GFP 유전자는 pDON-AI vector (pDON-AI-GFP)의
BamH I 위치로 삽입되었다. 이 플라스미드를 packaging cell에 transfection하여 재조합 retrovirus를 생산하였다. Transduction을 위해 CD34+ HSC를 SCF, IL-3, IL-6로 pre-stimulation하였다. CD34+ cell은 RetroNectin
®이 코팅된 플레이트 또는 Polaybrene이 있는 상태에서 준비된 재조합 retrovirus (DON-AI-GFP)로 감염시켰다. 그리고 48시간 후, GFP를 발현하는 세포를 flow cytometry로 확인하였다.
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