본 페이지는 In-Fusion^® cloning의 기본적인 troubleshooting을 안내합니다.
FAQ에 대해 더 자세한 정보는 링크를 이용해주세요

상황1. Transformation 이후에 얻어낸 colony가 아예 없거나 거의 보이지 않습니다.
Transformation 효율은 cloning의 성패를 결정하는 가장 중요한 요소 중 하나입니다.
Transformation 효율이 낮은 경우 반응에 필요한 반응물을 모두 넣었는지 확인하고, 사용한 competent cell의 효율과 사용한 DNA의 퀄리티를 체크해야 합니다. 다음과 같은 문제가 원인일 수 있습니다.

[Transformation 효율이 낮다면 아래 사항을 검토할 수 있습니다.]

• In-Fusion^® 반응액을 너무 많이 사용하여 transformation했을 경우
  : 50 ㎕의 comp. cell에 5 ㎕ 이상의 In-Fusion^® 반응액을 넣지 마세요.
• 사용한 competent cell이 In-Fusion^® 반응액에 민감할 경우
  : 효율이 낮은 경우 In-Fusion^® 반응액을 희석하여 사용하세요. 일부 strain의 경우 transformation 전에 TE 버퍼로 In-Fusion^® 반응액을 5~10배 희석하는 것이 더 나은 경우가 있습니다.
  (In-Fusion^® 반응액 10 ㎕에 TE 버퍼 40-90 ㎕ 추가)
• 사용한 E. coli cell이 competent 하지 않은 경우
  : Transformation 효율을 확인하세요. 효율은 1 x 10⁸ cfu/㎍ 이상이어야 하며 되도록 신선한 competent cells을 권장합니다. 또는 In-Fusion^® cloning에 최적화된 고효율 Stellar™ Competent Cells (Code 636763) 을 추천합니다.
• 2개 이상의 단편을 한 번에 multiple cloning을 했을 때 효율이 낮을 경우
  : Primer의 상동 영역을 15 bp에서 20 bp로 늘리세요. 12 bp 보다 짧거나 21 bp 보다 긴 길이의 상동 서열을 사용하는 것은 추천하지 않으며, 반응 시간을 늘리는 것은 추천하지 않습니다.

[아래 사항을 기반으로 사용한 DNA의 퀄리티를 체크할 수 있습니다.]

• In-Fusion^® 반응에 사용한 DNA 농도가 낮은 경우
  : 벡터나 insert의 양이 너무 적으면 반응이 적절히 이뤄지지 않기 때문에 In-Fusion^® 반응에서는 가능한 높은 농도로 DNA를 사용하는 것이 중요합니다. 따라서 최종 부피 10 ㎕ 의 반응에 벡터와 insert를 200 ng 만큼씩 사용하세요.
• Gel purification 시 DNA 단편에 불순물이 포함되었을 경우
  : 정제된 벡터와 insert의 총 부피는 5 ㎕를 초과해서는 안되기 때문에 젤 정제 후 사용한 DNA 단편은 In-Fusion^® 반응을 위해 높은 농도여야 합니다.
  가능하다면 PCR 반응을 최적화하여 순수한 PCR 산물을 생성하고 gel purification 대신 cloning enhancer를 사용하세요.
• PCR 반응물이 최적의 퀄리티가 아닌 경우
  : PCR 증폭을 반복하고 다른 정제 방법으로 반응물을 정제해보세요. 또는 기존 PCR 반응물에 대해 phenol:chloroform 추출 후 ethanol 침전을 수행해보세요.
• primer 서열이 잘못되었을 경우
  : insert 부위 영역의 15개 상동 염기의 서열이 올바른지 확인하세요.
  (온라인 툴 추천)

상황2. Insert가 없는 colony가 대부분입니다.
Colony PCR로 insert의 유무를 확인하는 경우, colony의 수는 충분하더라도 insert가 없는 경우가 있습니다. 이때 다음과 같은 문제점이 원인일 수 있습니다.

• 벡터의 선형화가 제대로 이루어지지 않았을 경우
  : In-Fusion^® 반응에 사용하기 전에 잘리지 않은 벡터를 제거하는 것이 중요합니다. 필요 시 벡터를 다시 자르고 전기영동을 통해 정제하세요.
• 동일한 항생제 내성을 갖는 플라스미드에 In-Fusion^® 반응물이 오염된 경우
  : Insert가 플라스미드에서 증폭되어 얻어진 경우, 플라스미드가 정제 과정에서 걸러지지 않고 cloning 반응물에 포함되었을 수 있습니다. 플라스미드 오염을 제거하기 위해선 PCR을 수행하기 전에 template DNA를 선형화하는 것을 권장합니다. 이후 DpnⅠ처리로 PCR 산물에 남아있는 template DNA를 제거하거나 TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit (Code 9761A)를 이용하여 PCR Clean-up하세요.
• 플레이트가 오래되었거나 잘못된 항생제를 사용했을 경우
  : 사용한 항생제 배지가 적절한지, 만든 지 1개월 이내의 배지를 사용했는지 확인하세요.

상황3. 형성된 colony에 다르거나 원치 않은 insert가 들어있습니다.
Colony PCR을 통해 insert band를 확인했지만 사이즈가 다른 경우, 또는 뚜렷한 single band가 아닐 경우 PCR 반응물에 비특이적 서열이 포함된 것이 원인일 수 있습니다. In-Fusion^® 반응을 위한 올바른 insert 삽입을 위하여 PCR 산물을 젤에 내려 정제해주세요. 이 경우 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (Code 9762A) 제품을 사용할 수 있습니다.