mRNA의 5’-cap 구조는 eukaryotic cell에서 translation, stabilization, transportation 등에 관여한다. 따라서 IVT (in vitro transcription)를 통한 mRNA 합성 후에도 translation에 관련된 downstream application을 위해 RNA의 capping이 매우 중요하다.

■ Basic mRNA structure
아래 그림은 IVT로 합성된 mRNA의 기본적인 구조 (5’-cap, 5’-UTR, CDS, 3’-UTR, poly(A) tail)이다. 이런 구조의 mRNA는 poly(A) binding protein (PABP) 등과 결합해 closed loop 구조를 형성하고 translation 시작에 관여한다. 또한, 이때 pseudouridine 같은 modified nucleoside가 종종 host cell에서의 면역원성을 낮추기 위해 같이 사용되곤 한다 (Kariko et al., 2008).


그림 1. IVT로 합성된 mRNA구조. eIF4F = Eukaryotic initiation factor 4F, 5′ UTR = 5′ untranslated region, CDS/ORF = coding sequence/open reading frame, 3′ UTR = 3′ untranslated region, PABP = poly(A) binding protein, m1Ψ = N1-methylpseudouridine.

여기서 5’-cap 구조는 N7분자가 메틸화된 guanosine으로 (m7G) mRNA의 5’-말단의 첫 nucleotide에 triphosphate linkage (PPP)로 연결되어 있다 (+1 position). 이런 구조를 m7G-ppp-N1혹은 cap-0라고 부른다. Eukaryotic cell에서는 여기서 5’-cap에 인접한 첫번째 nucleotide (+1)가 추가적으로 메틸화되고, 이를 cap-1이라 한다. Cap-1 구조는 mRNA의 면역원성을 낮춘다고 알려져 있다.

■ Cap-0 와 cap-1 mRNA 구조
Cap-0와 cap-1의 구조는 아래에서 확인할 수 있다 (그림 2). cap-1 구조는 세포에서 mRNA의 self와 non-self를 구분하는데 관여하기 때문에 in vivo 적용시 낮은 면역원성을 위해 꼭 필요하다.


그림 2. Cap-0와 cap-1구조의 비교. cap-1 mRNA는 첫번째 nucleotide에 methyl기가 추가되어 있다 (파란색). m7G = 5′ cap, ppp = triphosphate linkage, N1N2N3 = transcription start/initiation site (the first 3 nucleotides of the 5′ UTR), CDS = coding sequence.

■ Co-transcriptional vs. post-transcriptional capping
mRNA에 cap-1 구조를 추가하는 2 가지 방법이 있다. 첫 번째는 co-transcriptional capping으로 cap analog (그림 3; 왼쪽)를 사용하는 것이고, 두번째는 post-transcriptional capping으로 Vaccinia capping enzyme (Code 2460A)과 mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A) 같은 enzyme을 사용하는 방법이다(그림 3; 오른쪽).


그림 3. Co-transcriptional vs. Post-transcriptional capping 방법 (cap-1 구조). Co-transcriptional capping은 IVT에서 mRNA가 합성되면서 cap analog가 5’ 말단에 추가되는 방식으로 진행된다. 반면 post-transcriptional capping은 IVT가 끝난 후 5’ cap (cap-0 구조)가 vaccinia capping enzyme (VCE)에 의해 합성되고, 이후 transcription start site (N1)이 mRNA 2’-O-methyltransferase (2’-O-MTase)에 의해 변형되는 순서로 cap-1 구조가 형성된다.

Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (low dsRNA) (Code 6131)과, Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)은 co-transcriptional capping과 post-transcriptional capping 모두 적용 가능하다. 자세한 내용은 아래에서 확인할 수 있다.

- Co-transcriptional capping tech note
- Post-transcriptional capping tech note

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