3세대 유전자 가위 CRISPR/Cas9을 사용한 유전자 편집은 이미 여러 분야에서 폭넓게 사용되고 있다. 그 중에서도 다양한 세포로 분화 가능한 줄기세포의 유전자 편집 연구는 많은 관심이 집중되고 있는 분야이다. 하지만 실제로 줄기세포를 사용한 유전자 편집 프로젝트에는 여러 어려움이 존재하며, 단순한 유전자 knock-out 실험도 6개월 이상 소요되는 것이 일반적이다.


그림1. Human iPS 세포는 정상세포는 물론 질병모델 세포의 안전하고 무한적인 공급원이 될 수 있다.

줄기세포 유전자 편집의 어려움과 해결방안

유전자 편집도구로CRISPR/Cas9 성능과 유용함에도 불구하고, 유전자 편집할 에는 다양한 문제가 존재한다. 1. Cas9과 sgRNA의 효율적인 세포 내 도입과 2. 세포 독성 3. Off-target effect의 최소화.

이와 더불어 hiPS 세포의 경우 Cas9에 의해 유전자 편집된 단일세포를 세포주의 증식능력 및 미분화를 유지하며 확대배양 해야 하는 보다 더 어려운 문제를 가지고 있다.

(1) 최고의 도입효율과 genome foot print free 유전자 편집: Guide-it™ Recombinant Cas9

유전자편집의 어려움을 해결하기 위해 개발된 Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)는sgRNA와 결합하여 단백질 형태로 세포로 도입되기 때문에 세포 내에서 지속적으로 발현하지 않고 특히 조혈줄기세포 및 hiPS 세포를 포함해 편집이 어려운 세포에서도 높은 수준의 유전자 제거(knock-out) 및 homology-directed repair(HDR)을 통한 유전자도입을 실현 할 수 있다.


그림2. Takara의 재조합 Cas9 단백질은 개선된 sgRNA의 특징과, 제품의 낮은 glycerol 농도, C말단의 nuclear localization signal(NLS)을 포함하여 타사의 rCas9 제품에 비해 월등한 유전자 편집효율을 보여준다.

(2) 유전자편집된 줄기세포의 확대배양과 미분화유지 : Cellartis^® DEF-CS™ 500 Culture System

hiPS 세포의 편집 후 single cell cloning에 관련된 문제점을 극복하기 위해 Cellartis의 DEF-CS 배양시스템을 사용한다. DEF-CS는 defined, feeder-free 배양 시스템으로 enzyme passage 방법을 사용해 single cell dissociation된 hiPS세포를 장기간 균일하게 배양 유지할 수 있으며(Asplund etal. 2016), DEF-CS배양 환경에서 hiPS세포는 균일한 monolayer를 형성하며 배양할 수 있어 single cell cloning과정을 가능하게 한다 (Feng et al. 2014).

<다양한 iPSC 배양배지를 사용한 single cell cloning 효율 비교>


그림3. 유전자 편집 후, single cell로 부착된 세가지 hiPS세포주가 서로 다른 배지에서 colony로 확대 배양되는 것을 확인하였다. DEF-CS 에서 배양된 single cell이 사멸하지 않고 colony로 확대 배양되는 비율이 가장 높았다.


그림4. 그림3 에서 확대배양한 colony의 미분화 마커를 확인하였다. 타사 제품에서 확대 배양한 세포주가 미분화 능을 잃어버리는 것에 비하여, DEF-CS 에서 확대 배양된 colony는 경우 90%이상의 미분화 마커 발현을 보이는 것을 확인하였다.


그림5. DEF-CS 배양시스템은 single cell상태에서 미분화 상태의 hiPS세포를 강력하게 유지한다. 그림3의 클론 생성 데이터와 그림4의 >90%이상의 미분화 마커(TRA-1-60⁺/ SSEA-4⁺)가 발현된 세포의 비율을 결합하여 single cell에서 미분화를 유지하며 확대배양된 비율을 계산하였다.


그림6. DEF-CS를 사용하여 96well 에 부착된 하나의 hiPS세포가 8일만에 정상적인 colony로 확대 되는 과정을 확인하였다.

- CD81 Knock-out hiPS cell line 제작

위에서 소개한 Cas9 RNP와 single cell cloning 방법을 사용하여 integrin과 복합체를 형성하고 바이러스의 감염과정에서 중요한 역할을 하는 membrane glycoprotein CD81을 표적으로 Knock-out 과정을 실행하였다.


그림7. 두 가지 human iPSC cell line ChiPSC18과 ChiPSC22을 이용하여 CD81 유전자 편집(제거)를 위한 Work-flow. CD81 target CRISPR/ Cas9 RNP 도입으로 유전자 발현을 제거하고 DEF-CS배양시스템을 사용하여 single cell cloning 과정을 통하여 유전자 편집 후 단일 클론을 형성하였다.

Cellartis Human iPS Cell Line (ChiPSC)에서 CD81의 Knock-out은 Cellartis iPSC rCas9의 세포내 도입 eletroporation protocol에 따라 수행되었다. CD81을 target하는 sgRNA와 rCas9의 RNP 복합체를 eletroporation장비를 사용하여 세포내로 도입하고 7일 후 전체 cell population을 FACS를 사용하여 CD81 knock-out 된 세포를 분류하였다. 이어서, 분류한 세포를 limited dilution을 사용하여 적정농도로 희석시킨 후 96-well 플레이트의 각 well에 분주하였다. 각 well에 분주한 single hiPSC 세포는 각각 클론라인으로 확대 배양시키고 각종 미분화 마커와 karyotype을 진행하여 검증하였다.


그림8. 유전자 편집된 줄기세포의 미분화능 유지. A. Electroporation을 사용한 Cas9 RNP 도입으로 CD81이 86.8% knock-out 되었음을 확인하였고 B. CD81 Knockout 세포의 미분화마커 OCT-4, SSEA-4에 대해 확인한 결과 대부분의 세포에서 pluripotency가 유지되고 있음을 확인하였다.

세포주 ChiPSC cell line	획득방법 Isolation method	Single cell 유래 콜로니 생성의 수	생성되는 최대 콜로니 수	Single cell 유래 콜로니 생성 효율
ChiPSC 22	Limiting dilution	31	50	62%
ChiPSC 18	FACS	52	96	54%
ChiPSC 18	Limiting dilution	33	50	66%

표1. 유전자 편집한 single cell에서 단일 클론으로 확대 배양한 결과, 일반적인 경우 1~5%의 single cell survival 비율이 Cellartis^® DEF-CS™ 500 Culture System을 사용했을 때 54~66%로 증가되는 것을 확인할 수 있다.


그림9. 유전자 편집된 single cell에서 배양된 단일클론들은 pluripotecy를 유지한다. CD81 knock-out된 hiPS 세포주에서 유래된 클론들을 확대배양한 후 그 population을 CD81, Oct-4, TRA-1-60, SSEA-4 항체를 사용하여 확인하였다. Control을 제외한 모든 clone에서 target CD81은 제거되고 Pluripotent marker인 Oct-4, TRA-1-60, SSEA-4가 발현하고 있는 것을 확인하였다.


그림10. CRISPR/Cas9으로 CD81 편집된 hiPS 세포 클론의 indel mutation. 단일클론들에서 확인한 CD81 target site에서 유래된 sequence를 확인한 결과 NHEJ법을 사용해 gene knock-out를 실행한 homogenous한 클론들이 각기 다양한 indel mutation을 가지는 것을 확인하였다

Diversity of indels in CRISPR/Cas9 gesicle-treated hiPS cell clones
Clone #		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Indels (bp)	Allele 1	+1	+3/ -26	-1	-1	-17	-21	-4	-8	+53	-1	-1	+1/-3
	Allele 2	+1	-7	-7	+1	+1	-1	-18	-1	+51	-1	-11	-2

표2. CRISPR/Cas9으로 CD81 편집된 hiPS 세포 클론의 다양한 indel mutation 결과. 그림 10에서 표현된 다양한 indel을 정리하였다 +는 Cas9의 CD81 target digestion site를 기점으로 추가된 nucleotide의 수를, - 는 제거된 nucleotide의 수를 나타낸다.


그림11. 정상적인 karyotype 검증. 유전자 편집된 hiPS 세포주를 확대 배양한 후 ChiPSC18 세포주의 #6번 클론을 검사한 결과 정상적인 46개, XY karyotype을 가지고있음을 확인했다

Conclusions

Cellartis의 rCas9을 사용한 줄기세포 single cell cloning system은 효과적이며 빠르게 유전자 편집된 단일 hiPS 세포 클론을 형성할 수 있다. 이 시스템을 통해 유전자 편집된 줄기세포 클론은 줄기세포의 pluripotecy와 정상적인 핵형을 유지하여 이후 세포분화, 질병모델링 등의 사용에 적합하다.