CRISPR/Cas9은 유전자 편집 및 기능 분석을 위한 혁신적인 기술로, 다카라가 제공하는 Guide-it™ 제품은 보다 효율적이고 용이한 CRISPR 유전자 편집 실험을 도와드립니다. 이미 많은 고객들이 Guide-it™ 제품을 사용하여 좋은 실험 데이터를 얻었는데요. 왜 연구자들이 Guide-it™ CRISPR/Cas9 제품을 선택했는지 함께 보시죠!



Introduction
Manabu Toyoshima 박사는 조현병과 발달장애 환자로부터 유래한 iPS 세포를 이용해 질병 메커니즘과 잠재적 치료법을 규명하고자 하였다. 이에 Toyoshima 박사는 가장 높은 편집 효율을 가진 single guide RNAs (sgRNAs)를 선별하기 위하여 당사의 Guide-it™ Complete sgRNA Screening System을 사용하였다.

Result
Human iPS 세포 중 하나의 목적 유전자를 타겟하는 5개의 sgRNA를 디자인 후, Guide-it™ Complete sgRNA Screening System을 이용하여 각 sgRNA의 절단 효율을 in vitro 상에서 확인하였다. 결과에 따라 가장 효율이 높은 2개의 sgRNA (No. 2 & No. 4)를 Human iPS 세포의 CRISPR Knock-out 실험에 사용하였다. 또한 생성된 변이 (Mutagenesis)는 당사의 Guide-it™ Mutation Detection Kit로 확인하였다.


그림 1. Guide-it™ Complete sgRNA Screening System을 이용한 sgRNA의 in vitro 절단효율.
sgRNA No.2와 No.4의 절단 효율이 가장 높은 것으로 확인되었으며, 이 두 개의 sgRNA를 iPS 세포 유전자 편집에 활용하였다.


그림 2. Human iPS 세포에서 유전자 편집 효율.
Guide-it™ Mutation Detection Kit를 이용하여 sgRNA No.2와 No.4의 유전자 편집 효율을 확인하였다.



Introduction
Kazuki Nakao 박사는 transgenic mouse의 체외수정 (In vitro fertilization, IVF)과 냉동보존법 (cryopreservation)을 주로 연구하고 있다. Nakao 박사는 최근, 다카라에서 제공하는 Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)이 타사의 Cas9 단백질에 비하여 성능이 보다 우수함을 증명하는 데이터를 제공하였다.

Result
C57BL/6N mouse 배아에서 tyrosinase locus 부위를 유전자 편집하기 위하여 Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)을 이용하여 electroporation 하였다. 14.5일령의 mouse 태아를 사용하였고, tyrosinase locus의 유전자 편집 성공률은 알비노 특징을 보이는 태아의 수로 확인하였다.

Manufacturer	Cas9 concentration (ng/μl)	Number of embryos subjected to electroporation	Number of implanted electroporated embryos	Number of fetuses	Number of albino fetuses
Takara Bio	25	60	60	12	9
	100	60	60	7	7
Company A	25	60	60	13	2
	100	60	60	23	12
	400	40	40	7	4
Company B	25	60	59	22	0

표 1. Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)과 타 사의 Cas9 단백질을 이용한 tyrosinase 유전자 편집의 결과.
Takara Bio의 Guide-it™ Recombinant Cas9은 타사 제품에 비해 낮은 글리세롤 농도를 보유하고 있어 세포 독성이 낮을 뿐만 아니라 높은 유전자 편집 효율을 보인다. Guide-it™ Recombinant Cas9의 유전자 편집 성공률은 25 ng/㎕ Cas9을 도입했을 때 75%, 100ng/㎕ Cas9을 도입했을 때 100%를 보였다. 이는 A사의 제품, B사의 제품을 사용하였을 때보다 월등히 높은 유전자 편집 효율임을 확인하였다. (A사 제품의 유전자 편집효율: 15%, 52%, 57% / B사 제품의 유전자 편집효율: 0%)



Introduction
Result
C57BL/6 mouse embryo에 Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)와 donor construct (표 2 참조)를 microinjection하여 유전자 편집을 유도하였다. 유전자편집의 성공확률은 도입한 유전자를 보유하고 있는 새끼의 비율로 확인하였다.

Gene name	Type (insertion cassette/deletion length)	Donor	Litter size	Pups containing modification	Efficiency
Gene A	Insert (length: 3 kb)	Plasmid	9	4	44%
Gene B	Insert (length: 7.5 kb)	Plasmid	11	4	36%
Gene C	Knockout (deletion length: 51 kb)	Oligo DNA donor	14	4	28%
Gene D	SNP	Oligo DNA donor	8	2	25%
Gene E	Flox	Plasmid	6	2	33%
Gene F	Flox	Plasmid	8	2	25%