■ Overview
AAV 벡터는 증식 세포 (proliferating cells) 및 비증식 세포 (nonproliferating cells)에 유전자를 transduction할 수 있으며, 특히 비분할 세포 (nondividing cells)에서 장기적으로 transgene을 발현할 수 있다. 또한 AAV벡터는 면역원성이 낮고, 유전자를 in vivo로 whole organism에 transduction하는데 매우 적합하다. 그러나 각 개체에 도입되는 AAV벡터의 양은 투여 방법 및 타겟 종에 따라 다르고, 일반적으로 사용되는 동물 (예: 마우스)은 작은 개체 크기로 인해 도입량이 제한되기 때문에, 고농축된 AAV벡터가 필요하다. AAVpro^® Concentrator (Code 6674)는 일반 원심분리기를 사용하여 세포 배양 상등액에서 모든 혈청형의 AAV 입자를 농축할 수 있는 간편하면서 매우 효율적인 방법을 제공한다. 이 제품은 serum 유무에 관계없이 배양 상등액에서 AAV벡터를 농축할 수 있으며, AAV 용액의 buffer 교환 등 다양한 응용 분야에 사용할 수 있다.

• 세포 배양 상등액에서 AAV 입자를 효율적으로 농축
• 간단한 mix & spin 프로토콜로 hands-on time이 1시간 이내이며, 초원심분리기 불필요
• 불순물 제거를 위한 필터 단계가 포함
• 다양한 input volume을 처리할 수 있어 간단한 스케일업 가능

■ Simple workflow
AAVpro^® Concentrator (Code 6674)를 사용하면 일반 원심분리기를 사용하여 AAV벡터를 쉽고 효율적으로 농축할 수 있다.
또한 AAV 침전만 진행하는 다른 농축 방법과 달리, AAVpro^® Concentrator (Code 6674)는 필터 단계를 추가하여 더 높은 순도로 AAV를 얻는 것이 가능하다. 스케일 확장 가능한 mix & spin 프로토콜은 다양한 input volume에 적용할 수 있으며, hands-on time이 1시간 이내다. 그림 1은 AAVpro^® Concentrator (Code 6674)를 사용하여 AAV 벡터를 준비하고 정제하는 워크플로우를 나타낸다.


그림 1. AAVpro^® Concentrator를 사용한 AAV 벡터 농축 프로세스 개요

■ AAV concentration
Concentration of AAV vectors from serum-free culture supernatant
ZsGreen1을 발현하는 AAV1 벡터가 포함된 배양 상등액을 AAVpro^® Concentrator (Code 6674)를 사용하여 40 ㎖ (T225 플라스크 1개)를 최종 200 ㎕까지 농축하였다. 바이러스 회수율을 확인하기 위해 AAVpro^® Titration Kit (for Real Time PCR) 를 이용하여 농축 전 후에 바이러스 역가를 측정하였다.

그림 2. AAVpro^® Concentrator를 사용하여 농축된 AAV1 벡터의 농도 및 회수율 (recovery rate).

■ AAV titer
Biological titer of concentrated AAV vectors
AAV의 감염성을 테스트하는데 일반적으로 사용되는 생물학적 분석은 감염허용세포를 AAV로 감염시킨 후, 도입 유전자의 발현을 측정하여 transducing units (TUs)의 역가를 결정하는 방법이 대표적이다. AAVpro^® Concentrator (Code 6674)를 사용하여 농축된 AAV의 감염성을 확인하기 위해 농축 전과 후의 ZsGreen1-AAV1을 HT1080 세포로 각각 감염시켜 유세포분석 방법으로 ZsGreen 발현을 비교하였다. HT1080 세포에 AAV를 5,000 또는 500 vg/cell (MOI)로 감염시키고 3일 후에 FACS 분석한 결과 5,000 또는 500 MOI로 감염된 농축된 AAV는 각각 44.7%, 9.2% 비율로 세포를 감염시킬 수 있었다.

그림 3. transducing units의 AAV 역가 측정.
HT1080 세포에서의 ZsGreen1 발현을 FACS 분석을 통해 결정하였다.

■ Conclusions
AAVpro^® Concentrator (Code 6674)은 다카라 AAV 시스템을 사용하여 제작한 바이러스 외에도 세포 배양과 달리 상등액에서 모든 혈청형의 AAV 입자를 농축하는데 사용할 수 있다. 초원심분리를 사용하는 기존의 방법에 비해 사용자 친화적인 AAVpro^® Concentrator (Code 6674) 프로토콜은 간편하고 매우 짧은 hands-on time을 제공한다. 또한 일반적인 실험실 기기만을 사용하여 실험을 진행할 수 있다. 배양 상등액 40㎖를 최종 부피 200㎕까지 농축할 수 있으며, ~48% 회수율로 AAV 역가를 95배 증가시킬 수 있었다. AAVpro^® Concentrator (Code 6674) 프로토콜에 필터 및 ultrafilter 단계를 추가하면 downstream 실험을 방해할 수 있는 불순물을 제거할 수 있다. AAVpro^® Concentrator (Code 6674)는 serum의 유무와 상관없이 상등액에 적용이 가능하며, buffer를 교환할 때도 사용할 수 있다.