※ Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (low dsRNA) (Code 6131)은
in vitro transcription (IVT)을 위한 all-in-one kit로 Cloning Kit for mRNA Template (
BspQ I) (Code 6133) + Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (low dsRNA) (Code 6134)로 구성된 제품입니다.
- in vitro transcription (IVT) 반응에 PrimeCap® T7 RNA Polymerase (low dsRNA) (Code 2560A)을 사용하여 dsRNA 생성을 크게 억제하여 생체투여 시 면역원성 감소 (Code 6134)
- Cap 구조와 Poly (A) 서열을 가진 mRNA를 쉽게 합성할 수 있는 all-in-one-kit
- BspQ I (Code 1227A)을 사용하여 Poly(A) 서열 후 추가서열 없이 scarless mRNA용 합성 template을 제작 가능 (Code 6133)
제품설명
Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (low dsRNA) (Code 6131)은 Cap 구조와 Poly(A) 서열을 가진 mRNA를 간편하게 고효율로 합성하는 all-in-one kit이다. 이 시스템은 아래와 같이 ① TriLink의 Cap analog (CleanCap® Reagent AG 또는CleanCap® Reagent AG (3’OMe))를 사용하여 template plasmid를 제작할 때 Poly(A) 서열 뒤에 추가 염기가 없는 scarless IVT template plasmid를 제작하는 Kit 와 ② template plasmid를 주형으로 PrimeCap® T7 RNA Polymerase (low dsRNA) (Code 2560A)로 dsRNA 생성을 억제하며 고품질의 고수율 mRNA를 합성하는 Kit로 구성되어 있다.
* 이 제품에는 Cap analog가 포함되어 있지 않습니다. CleanCap® Reagent AG (TriLink)는 별도로 준비 바랍니다.
① Cloning Kit for mRNA Template (BspQ I) (Code 6133): Template vector 제작
: IVT template plasmid 제작을 위해 In-Fusion® cloning용 linearized vector, In-Fusion® 시약 및 control fragment (FLuc)로 구성되어 있다. Linearized vector는 T7 promoter, transcriptional start sequence (AGG), 5’-UTR (untranslated region), 3’-UTR 및 Poly(A) 서열 (141 base)이 포함되어 있으며, 발현하고자 하는 유전자의 코딩서열 (CDS; coding sequence)만 vector에 cloning 하면 human이나 mouse 등 mammalian 세포에서 사용할 수 있는 mRNA 합성용 plasmid 제작이 가능하다. 특히 이 vector에는 Poly(A) 서열 바로 다음에 BspQ I (Type IIS 제한효소) 인식서열이 있어 추가서열이 없는 scarless mRNA 합성이 가능하다.
② Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (low dsRNA) (Code 6134): 고수율 mRNA 합성
: Template plasmid를 주형으로 in vitro transcription (IVT)하는 제품이다. 체내에서 면역원성으로 작용하는 dsRNA의 생성을 크게 억제하면서 고품질, 고수율의 mRNA를 합성할 수 있다. CleanCap Reagent AG (TriLink; Code N-7113) 등을 이용하면 진핵생물에서 단백질의 translation에 필요한 5’-Cap 구조를 가지는 mRNA를 효율적으로 제작할 수 있다. 또는 본 제품으로 제작한 mRNA에 enzymatic capping 방법으로 Faustovirus Capping Enzyme (S17) (Code 2480A) 혹은 Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)와 함께 mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)를 사용해 5’-Cap 구조를 부가하는 것도 가능하다. 이외 세포 도입시 면역원성을 낮추기 위해 UTP 대신 pseudo-UTP 등을 사용해도 mRNA 합성 수율 저해 없이 사용할 수 있다.
그림 1. FLuc mRNA (약 1.9 kb)를 합성하여 수율, dsRNA함량, 단백질 발현 수준 비교.
FLuc (Positive Control Template)을 사용해 본 제품 (Takara IVTpro™ mRNA Synthesis kit (low dsRNA)(code 6134)), 기존 제품 (Takara IVTpro™ mRNA Synthesis kit (Code 6144)) 및 A사 제품을 이용해 CleanCap®의 유무에 따라 표준 프로토콜로 IVT한 뒤 결과를 비교하였다 (그래프는 각 제품에 포함된 T7 RNA Polymerase 이름으로 작성). 그 결과, (A) 본 제품과 기존 제품 모두에서 CleanCap®의 유무에 상관없이 mRNA 합성 수율이 높았고, (B) 본 제품을 이용하면 기존 제품 대비 dsRNA 생성이 약 95% 억제됨을 확인할 수 있었다. 또한, (C) 합성된 mRNA를 HEK293T 세포에 transfection하고 FLuc assay로 단백질의 세포내 발현 수준을 측정한 결과, 본 제품으로 합성된 mRNA의 단백질 발현 수준이 가장 높음을 확인하였다.
용도
- IVT 용 template plamsid DNA 제작
- Poly(A) 서열 후 추가 염기 없는 scarless mRNA 합성
- CleanCap® Reagent AG (TriLink BioTechnologies)를 사용하는 IVT
- Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) 등의 Cap analog를 이용한 capped mRNA 합성
(※ARCA 사용 시 본 제품 template (Code 6133; Code 6146)과 다른 서열이 필요하니 주의 바랍니다.)
- Long non-coding RNA 합성
- Guide RNA 합성
- siRNA precursor 합성
- RT-qPCR용 RNA standard template 합성
- Hybridization을 위한 RNA probe 합성
내용
Cloning Kit for mRNA Template (BspQ I) (Code 6133) (10회)
| Linearized Template Vector (BspQ I) (50 ng/㎕) |
10 ㎕ |
FLuc Control Fragment (BspQ I) (100 ng/㎕)*1 |
10 ㎕ |
5× In-Fusion Snap Assembly Master Mix*2 |
20 ㎕ |
Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (low dsRNA) (Code 6134) (20회)
| 10× Transcription Buffer |
40 ㎕ |
10× ATP |
40 ㎕ |
10× CTP |
40 ㎕ |
10× GTP |
40 ㎕ |
10× UTP |
40 ㎕ |
10× Enzyme Mix 2 |
40 ㎕ |
Nuclease-Free Water |
1 ㎖ x 3 |
DNase I |
80 ㎕ |
Lithium Chloride Precipitation Solution |
600 ㎕ |
Positive Control Template (FLuc) (0.5 μg/㎕)*3 |
10 ㎕ |
*1 Human 세포에서 발현에 최적화된 Photinus pyralis luciferase codon의 CDS
*2 In-Fusion® Snap Assembly Master Mix (Code 638947 외)와 동일한 시약
*3 T7 promoter+5’UTR+Fluc-CDS+3’UTR+Poly(A)로 구성된 염기서열을 가진 선형화된 plasmid DNA
BspQ I (Code 1227A)
| BspQ I (10 U/㎕) |
500 U |
10x BspQ I Buffer* |
1 ㎖ |
* 본 버퍼에는 BSA가 포함되어 있지 않습니다.
사용상의 주의
- 이 제품은 mRNA를 합성하는 시약이다. RNase가 dsDNA template, 시약, 반응에 사용되는 tube, micropipette 팁 등에 오염되면 반응 후 얻은 RNA의 수율이 감소하거나 RNA가 단편화 될 수 있다. 반응에 사용하는 tube와 micropipette 팁을 따로 관리하고, RNase 오염을 방지하기 위해 일회용 장갑을 착용하도록 권장한다.
- 사용중 enzyme은 얼음 위에 놓고 과도한 교반 및 반복적인 freeze/thaw 과정을 피해야 한다.
- Lithium chloride Precipitation Solution은 사용 전 실온에서 해동하고, 융해 후 잘 혼합한다. 침전물이 보일 경우 37 ℃에서 인큐베이션하고, 이후 남은 침전물은 그대로 사용해도 되며 성능에는 영향을 주지 않는다.
보존 -20℃
Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (low dsRNA) (Code 6131) 이외에 필요 시약 (주요 시약)
- Transformation을 위한 competent cell 및 시약
- CleanCap® Reagent AG (TriLink Biotechnology)
- pseudo-UTP 등의 변형 nucleotide
- 제한효소 (BspQ I (Code 1227A))
※서열정보
* Positive Control Template (FLuc)에 2,685 ~ 4,367 (1,683 bp)와 동일하다.
관련제품
- In-Fusion® cloning시 개선된 colony 형성 능력으로 성능은 up 가격은 down In-Fusion® Snap Assembly Master Mix (Code 638947)
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- mRNA 전용 transfection 시약 TransIT®-mRNA Transfection Kit (Code MIR 2250)
- dsRNA 생성이 적은 고품질 mRNA 합성 효소 PrimeCap® T7 RNA Polymerase (low dsRNA) (Code 2560A)
- RNA, DNA 합성 시 PPi를 제거하여 수율을 높이는 Pyrophosphatase (inorganic) (Code 2450A)
- Capping enzyme (uncapped RNA -> Cap0 RNA): Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)
- Capping enzyme (Cap0 RNA -> Cap1 RNA): mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)
- 다양한 온도에서 반응할 수 있는 Capping enzyme (uncapped RNA -> Cap0 RNA): Faustovirus Capping Enzyme (S17) (Code 2480A)
