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Real Time PCR로 Mycoplasma 신속 검출

CycleavePCR Mycoplasma Detection Kit

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제조사 제품코드 제품명 용량 가격
(부가세별도)		 비고 사용자매뉴얼
Takara
 CY232
 CycleavePCR Mycoplasma Detection Kit
관련학술 구매하기 		50회
 413,000원  CY232_e.v1903Da.pdf

제품설명
본 제품은 Mycoplasma 16S rRNA 유전자를 타겟으로 Real Time PCR 장치를 이용해 대부분의 Mycoplasma를 특이적으로 검출하기 위한 kit이다. 적어도 Mycoplasma 속 중의 10종(M. arginini, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale, M. salivarium, M. fermentas, M. bovis, M. arthritidis, M. pirum, M. pneumoniae) 및 Acholeplasma 속 중의 1종(A. laidlawii)에 대해 매우 민감하게 검출할 수 있음을 확인하였다.
본 kit의 증폭 반응에는 Hot Start PCR용 효소인 TaKaRa Ex Taq HS를 사용하고 있어 반응액 조제 혹은 반응(본격적인 cycle 반응)전에 miss-priming이나 primer dimer에서 유래하는 비특이적 증폭을 막을 수 있다.
증폭 산물의 검출에는 cycling probe법을 사용하고 있다. 이 방법은 RNA와 DNA로 구성된 키메라 probe(chimera probe)와 RNase H와의 조합에 의한 고감도 검출 방법으로, 매우 특이성이 높은 검출이 가능하다. Probe는 한쪽 말단은 형광 물질로, 다른 말단은 그 형광 물질이 발하는 형광을 소광하는 물질(quencher)로 표지되어 있다. 이 cycling probe는 intact한 상태에서는 quenching에 의해 형광을 발할 수 없지만, 상보적인 증폭 산물과 하이브리드를 형성한 후에 RNase H에 의해 RNA 부분에서 절단되면, 강한 형광을 발하게 된다. 이러한 방법으로 형광 강도를 측정하여 증폭 산물량을 모니터 할 수 있다. 본 kit의 probe는 Mycoplasma에 특징적인 염기에 상보적으로 결합하는 염기 부분을 RNA로 하고 있기 때문에, Mycoplasma만을 특이적으로 고감도에 검출하는 것이 가능하다.
내용
1. 2×CycleavePCR Reaction Mix 625 μl 　
2. Myco. Primer/Probe Mix(5×conc.) 250 μl *1
3. RNase Free dH2O   1 ml
4. Myco. Positive Control(1×106 copies/μl)  20 μl *2
5. Proteinase k  50 μl 　
*1 형광 표지 probe를 포함하고 있으므로 차광에 유의한다.
*2 Real time PCR component (1~3)에 잘못해 혼입하면 올바른 검출 반응을 실시할 수 없게 된다. 별도의 보관케이스를 마련하여 따로 보존한다.
보존
- 20℃
kit 이외에 필요한 기기, 시약
* Real Time PCR용 증폭 장치 및 전용 튜브
   Thermal Cycler Dice Real Time System II(TP900/TP960)
   Thermal Cycler Dice Real Time System Lite(TP700/TP760)
      해석에는 Thermal Cycler Dice Real Time System Software Ver.4.0을 사용.
   Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System(Life Technologies)
* 200 μl, 20 μl, 10 μl 각 micropipette, tips
* 탁상원심기 등
Positive Control에 대해
Mycoplasma Positive Control을 주형으로 Mycoplasma Primer로 증폭된 PCR 산물은, FAM 표지 probe 검출 영역과 ROX 표지 probe 검출 영역의 양쪽 모두를 포함하고, FAM 표지 probe와 ROX 표지 probe 모두에서 검출된다. 샘플 중에 저해 물질이 포함되어 있는지 확인하기 위해서는 사용하는 샘플에 Mycoplasma Positive Control을 첨가하고 Control 실험을 실시해 ROX 필터로 검출 유무를 확인한다.

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