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Off-target effect 감소, Hard-to-transfect cell line을 위한 CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 Gesicle Production System

제조사	제품코드	제품명	용량	가격 (부가세별도)	사용자매뉴얼
Clontech	632613	Guide-it™ CRISPR/Cas9 Gesicle Production System	1 Kit (Package)	1,434,000원	,
Clontech	632616	Guide-it™ CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Set	1 Set	965,000원
Clontech	632617	Gesicle Producer 293T Cell Line	1 ml	737,000원	,
Clontech	632612	pGuide-it-sgRNA1 Vector System	1 Kit (Package)	692,000원	,

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Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle 실험 원리 및 개요 (클릭)

Cell-derived nanovesicle(Gesicle)을 이용하여 Cas9/sgRNA ribonucleoprotein(RNP)를 세포 내 직접 도입
Broad tropism: 다양한 Cell line에 적용 가능
Hard-to-transfection cell line (분열세포, 비분열세포, iPS 세포)에서도 효율적인 CRISPR/Cas9 Genome Editing 가능
Off-target effect 최소화: 도입된 Cas9/sgRNA Complex는 세포 내에서 신속하게 제거되어 Off-target effect를 줄일 수 있음

제품설명

Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production system은 Cas9/sgRNA Complex를 세포에 효율적으로 도입하기 위한 Cas9/sgRNA Gesicle을 제작하는 제품이다. Cas9/sgRNA Gesicle을 이용하면 Plasmid transfection이나 Virus transduction을 이용한 Genome Editing과 비교하여 더욱 다양한 세포주에 효율적으로 Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP)를 도입할 수 있다.
본 시스템에서는 target DNA specific-sgRNA를 발현하는 CRISRP/Cas9 plasmid를 Gesicle 제작용 세포인 Gesicle Producer 293T Cell Line (Code 632617)에 transfection하여 Cas9/sgRNA Gesicle을 제작한다.

Cas9/sgRNA Gescle 생성에 필요한 시약은 2개의 튜브에 동결건조 상태로 제공되며, sgRNA를 클로닝한 pGuide-it sgRNA1 Vector를 튜브에 첨가 후, 혼합물을 Gesicle Producer 293T Cell Line에 transfection함으로써 간단하게 Cas9/sgRNA Gesicle을 제작할 수 있다.

CRISPR/Cas9 Gesicle의 원리

Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System은 고농도의 Cas9/sgRNA를 포함한 Gesicle을 제작한다. Gesicle에는 Cas9 단백질, target specific sgRNA, CherryPicker Red Fluorosence protein, Glycoprotein으로 구성되어있다.

① sgRNA 서열을 삽입한 pGuide-it-sgRNA1 vector를 Gesicle Packaging Mix1과 Mix2를 이용하여 Gesicle Producer 293T Cell Line에 transfection하면 Gesicle Producer 293T Cell membrane에 Glycoprotein이 생성된다.
② 이 때, iDimerize 기술에 의하여 Cas9단백질/sgRNA complex와 CherryPicker 형광단백질이 Gesicle내에서 상호작용하게 되며, Gesicle 내로 봉입, 세포 외로 방출된다.
③ 배양액으로부터 회수한 Geiscle을 목적세포에 첨가하면 Gesicle이 세포막과 융합되어 Cas9/sgRNA Complex가 목적세로 내부로 방출된다.
④ NLS Tagging에 의하여 Cas9/sgRNA Complex는 목적세포의 핵 내부로 이동하며, 핵 내에서 Genome DNA의 target gene을 절단한다. 이 때, Gesicle에 포함되어있는 CherryPicker 형광단백질로 Cas9/sgRNA complex의 세포 내 도입을 모니터링할 수 있다.

그림 1. Cas9/sgRNA Gesicle의 제작과 세포 내 도입 원리

그림 2. Cas9/sgRNA Gesicle에 의한 다양한 세포의 Knock-out 효율

Cas9/sgRNA Gesicle을 이용하여 각 세포주에서 Zs-Green1을 Knock-out하였다. ZsGreen1 형광단백질을 목적으로 제작된 Cas9/sgRNA Gesicle 처리 (각각 10ul, 20ul, 30ul 첨가) 또는 CRISPR/Cas9 plasmid transfection하여 Knock-out 효율을 비교하였다. Cas9/sgRNA Gesicle을 이용할 경우 transfection 효율이 낮은 세포에 대하여 일정한 제거 효율을 얻을 수 있었다.

그림 3. Cas9-sgRNA gesicle을 사용한 endogenous protein(CD81) Knock-out

그림 4. hiPS 세포에서의 CD81 Knock-out
Human CD81을 타겟으로 디자인된 Cas9-sgRNA complex를 포함한 Gesicles를 회수 후, Cellartis human iPS cell line 18 (ChiPSC18) Kit (Code Y00305)에 처리하고 Cellartis DEF-CS Culture System (Code Y30010) 존재 하에 각각 6시간, 24시간동안 배양하였다. 그 후, Gesicle-free DEF-CS culture media로 배지 교환하여 7일간 추가 배양하였다.
Gesicle-treated cell과 untreated (control) cell의 CD81 발현율을 CD81을 타겟하는 FITC-labeled antibodies를 이용하여 flowcytometry로 측정하였다.
Panel A. DEF-hiPSC ChiPSC18 cell의 CD81 negative(왼쪽) control과 positive(오른쪽) control.
Panel B. Gesicle 처리 6시간(왼쪽), 24시간 (오른쪽) 후, DEF-hiPSC ChiPSC18 cell의 CD81 발현율

* iPS 세포의 CRISPR/Cas9 gene editing에 대한 자세한 내용은 아래를 클릭하여 확인하세요.
Footprint-free gene editing using CRISPR/Cas9 and single-cell cloning of edited human iPS cells

적용

CRISPR/Cas9-mediated gene editing
Stem cell research

구성품

Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System (Code 632613)
1.	Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Set (Code 632616)
	Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Mix 1(green cap) Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Mix 2(yellow cap) A/C Heterodimerizer(500 nM in Ethanol) Protamine Sulfate(4 mg/ml)	10 vials 10 vials 50μ l 200μ l
2.	Guide-it sgRNA Vector System (Code 632612)
	a. pGuide-it-sgRNA1 Vector(Linear)(7.5 ng/μ l)	12μ l
	b. Guide-it Ligation Components v2
	DNA Ligation Mighty Mix Guide-it Oligo Annealing Buffer Guide-it Control Annealed Oligos v2(100 fmol/μ l) Guide-it Sequencing Primer 1(100 pmol/μ l) PCR-Grade Water	50μ l 1.5 ml 10μ l 10μ l 1 ml
	c. Stellar Competent Cells (Code 636763)
	Stellar Competent Cells(100μ l/tube) SOC Medium(1 ml/tube) pUC19 Vector(0.1 ng/μ l)	10 tubes 10 tubes 10μ l
Gesicle Producer 293T Cell Line (Code 632617)
	Gesicle Producer 293T Cell Line	1 ml

보존

Stellar Competent Cells:-80℃
기타: -20℃

Gesicle Producer 293T Cell Line: 액체질소(-196°C) 또는 -150℃ freezer에 보관

Cell Line 취급 주의사항 (클릭)

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편집 유전자 도입

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