※ Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (
BspQ I) (Code 6148)은
in vitro transcription (IVT)을 위한 all-in-one kit로 #6133 + #6144로 구성된 제품입니다.
- Scarless mRNA를 간편하게 합성하는 all-in-one kit
- Type IIS 제한효소 BspQ I (Code 1227A) 인식서열이 있어 Poly(A) 이후 추가서열이 없는 scarless mRNA 합성 가능 (그림 1)
- T7 promoter, transcription start sequence (AGG), 5-UTR, 3’-UTR, Poly(A) 서열 (141 base)을 포함한 template vector를 linear한 형태로 제공 (#6133에 포함; #6146으로 단독구매 가능)
- In-Fusion® Snap Assembly Master Mix (Code 638947)로 빠르고 간단한 cloning가능
※ 본 제품은 In-Fusion
® 시약이 구성품으로 포함되어 있으며, 원활한 결과를 얻기 위해
제품 사용 전 In-Fusion® 원리(동영상링크)를 반드시 참고해주시기 바랍니다.
그림 1. 제한효소 BspQ I 인식서열 주변 서열 및 선형화 이후의 말단서열 구조
- Type IIS 제한효소
BspQ I의 인식서열 (
빨강색) 및 절단위치 (
파란색)
- Type IIS 제한효소의 절단위치는 인식서열의 외부에 위치한다. 따라서
BspQ I을 사용하는 것으로 Poly(A) 이후 여분 서열이 없는 mRNA 합성용 template을 제작할 수 있다
제품설명
Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (BspQ I) (Code 6148)은 scarless mRNA를 간편하게 합성하는 all-in-one kit로 Cap 구조와 Poly(A) 서열을 가진 mRNA를 고효율로 합성할 수 있다. 이 시스템은 아래와 같이 ① IVT template plasmid를 제작하는 Kit 와 ② 200 ㎍ / 20 ㎕의 고수율 IVT Kit로 구성되어 있다.
① Cloning Kit for mRNA Template (Code 6133): Template vector 제작
: IVT template plasmid 제작을 위해 In-Fusion® cloning용 linearized vector, In-Fusion® 시약 및 control fragment (FLuc)로 구성되어 있다. Linearized vector는 T7 promoter, transcriptional start sequence (AGG), 5’-UTR (untranslated region), 3’-UTR 및 Poly(A) 서열 (141 base)이 포함되어 있으며, 발현하고자 하는 유전자의 코딩서열 (CDS; coding sequence)만 vector에 cloning 하면 human이나 mouse 등 mammalian 세포에서 사용할 수 있는 mRNA 합성용 plasmid 제작이 가능하다. 특히 이 vector에는 Poly(A) 서열 바로 다음에 BspQ I (Type IIS 제한효소) 인식서열이 있어 추가서열이 없는 scarless mRNA 합성이 가능하다.
② Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144): 고수율 mRNA 합성
: 고효율 T7 RNA Polymerase를 바탕으로 200 ㎍ / 20 ㎕의 고수율 IVT가 가능하도록 조건을 최적화한 제품이다. 이 제품은 별도로 capping system (e.g. CleanCap® AG 외)을 추가하거나, modified NTP를 추가하는 등 다양한 조건에서도 높은 효율을 보인다.
용도
- IVT 용 template plamsid DNA 제작
- Poly(A) 서열 후 추가 염기 없는 scarless mRNA 합성
- CleanCap® Reagent AG (TriLink BioTechnologies)를 사용하는 IVT
- Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) 등의 Cap analog를 이용한 capped mRNA 합성
(※ARCA 사용 시 본 제품 template (#6133; #6146)에서 서열 변경이 필요하니 주의 바랍니다.)
- Long non-coding RNA 합성
- guide RNA 합성
- siRNA precursor 합성
- RT-qPCR용 RNA standard template 합성
- Hybridization을 위한 RNA probe 합성
내용
Cloning Kit for mRNA Template (BspQ I) (Code 6133) (10회)
| Linearized Template Vector (BspQ I) (50 ng/㎕) |
10 ㎕ |
FLuc Control Fragment (BspQ I) (100 ng/㎕)*1, 2 |
10 ㎕ |
5× In-Fusion Snap Assembly Master Mix*3 |
20 ㎕ |
Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144) (20회)
| 10× Transcription Buffer |
40 ㎕ |
10× ATP |
40 ㎕ |
10× CTP |
40 ㎕ |
10× GTP |
40 ㎕ |
10× UTP |
40 ㎕ |
10× Enzyme Mix |
40 ㎕ |
Nuclease-Free Water |
1 ㎖x 3 |
DNase I |
80 ㎕ |
Lithium Chloride Precipitation Solution |
600 ㎕ |
Positive Control Template (FLuc) (0.5 μg/㎕)*4 |
10 ㎕ |
*1 In-Fusion®을 위한 양 말단 15bp 상동서열 + Fluc-CDS로 구성된 control fragment (1,683 bp)
*2 Human 세포에서 발현에 최적화된 Photinus pyralis luciferase codon의 CDS
*3 In-Fusion® Snap Assembly Master Mix (Code 638947)와 동일한 시약
*4 T7 promoter+5’UTR+Fluc-CDS+3’UTR+Poly(A)로 구성된 염기서열을 가진 선형화된 plasmid DNA
Template Vector (BspQ I) for T7 mRNA Synthesis (Code 6146)
| Linearized Template Vector (BspQ I) (50 ng/㎕) |
10 ㎕ |
FLuc Control Fragment (BspQ I) (100 ng/㎕) |
10 ㎕ |
BspQ I (Code 1227A)
| BspQ I (10 U/㎕) |
500 U |
10x BspQ I Buffer* |
1 ㎖ |
* 본 버퍼에는 BSA가 포함되어 있지 않습니다.
사용상의 주의
- 이 제품은 mRNA를 합성하는 시약이다. RNase가 dsDNA template, 시약, 반응에 사용되는 tube, micropipette 팁 등에 오염되면 반응 후 얻은 RNA의 수율이 감소하거나 RNA가 단편화 될 수 있다. 반응에 사용하는 tube와 micropipette 팁을 따로 관리하고, RNase 오염을 방지하기 위해 일회용 장갑을 착용을 권장한다.
- 10x Enzyme Mix는 격렬한 교반을 피해야 한다.
- Lithium chloride Precipitation Solution은 사용 전 실온에서 해동하고, 융해 후 잘 혼합한다. 침전물이 보일 경우 37 ℃에서 인큐베이션하고, 이후 남은 침전물은 그대로 사용해도 되며 성능에는 영향을 주지 않는다.
보존 -20℃
Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (BspQ I) (Code 6148) 이외에 필요 시약 (주요 시약)
- CleanCap® Reagent AG (TriLink Biotechnology)
- pseudo-UTP 등의 변형 nucleotide
- 제한효소 (BspQ I (Code 1227A))
※서열정보
* Positive Control Template (FLuc)에 2,685 ~ 4,367 (1,683 bp)와 동일하다.
관련제품
- In-Fusion® cloning시 개선된 colony 형성 능력으로 성능은 up 가격은 down In-Fusion® Snap Assembly Master Mix (Code 638947)
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- 범용성 높은 High fidelity PCR 효소 PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase (Code R050A)
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- RNA, DNA 합성 시 PPi를 제거하여 수율을 높이는 Pyrophosphatase (inorganic) (Code 2450A)
- Capping enzyme (uncapped RNA -> Cap0 RNA): Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)
- Capping enzyme (Cap0 RNA -> Cap1 RNA): mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)
- 다양한 온도에서 반응할 수 있는 Capping enzyme (uncapped RNA -> Cap0 RNA): Faustovirus Capping Enzyme (S17) (Code 2480A)
