- Helper virus를 사용하지 않고 RNA 중합효소 III(pol III) 프로모터를 포함하는 serotype 1, 2, 5, 6, 8, 9 AAV 제작
- AAVpro
® Helper Free System (AAV-2xU6)는 두 종류의 shRNA를 동시에 발현 가능
제품 설명
Adeno-Associated Virus (AAV)는 분열하거나 분열하지 않는 세포 모두에 감염시킬 수 있는 non-enveloped single stranded DNA virus로 helper virus가 존재 시에만 복제가 가능하며 인간에게는 비병원성으로 다양한 세포에 유전자를 도입하는 유용한 방법이다. 특히, 유전자치료에 유용한 vector로 사용되고 있다.
AAV는 100개가 넘는 다양한 혈청형 (serotype)이 존재하고 혈청형에 따라 host나 바이러스의 특성이 다른 것으로 알려져 있다. Serotype 2 (AAV2)는 오래전부터 널리 연구되어 온 serotype으로 다양한 세포를 감염시킬 수 있다. Serotype 1 (AAV1), Serotype 5 (AAV5), Serotype 6 (AAV6), Serotype 8 (AAV8), Serotype 9 (AAV9)는 보다 조직 감염특이성을 가진 혈청형으로, AAV1은 근육, 간, 기도, 중추신경계 등에, AAV5는 중추신경계, 간, 망막 등에, AAV6는 심장, 근육, 간 등에, AAV8은 간, 근육, 중추신경계 등에, AAV9는 중추 신경계, 심장, 간, 근육 등에 대한 유전자 도입효율이 높다고 알려져 있다.
RNA interference (RNAi)는 이중가닥 RNA를 도입하여 타겟 유전자의 mRNA를 분해하여 유전자 발현을 조절 방법 중 하나로, mammalian 세포에서는 21~23 개의 짧은 이중가닥 RNA (siRNA; short interfering RNA)를 사용하여 RNAi 효과를 얻을 수 있다고 알려져 있다. RNAi 실험의 주요 방법은 합성 siRNA를 도입하거나, 발현 벡터를 사용하여 세포 내에서 siRNA를 생성하는 방법이다. 합성 siRNA의 RNAi 효과는 일시적이지만, 발현 벡터를 사용하면 RNAi 효과가 지속될 수 있다.
AAVpro® Helper Free System (AAV-2xU6)는 helper virus를 사용하지 않고 RNA 중합효소 III (pol III) 프로모터를 탑재한 각 serotype의 AAV를 제작하는 kit로, 생산된 AAV를 사용하면 in vitro 또는 in vivo에서 hairpin RNA를 일시적으로 발현시킬 수 있다. in vivo 실험 시 정제된 AAV를 사용하는 것을 권장한다.
그림 1. AAVpro® Helper Free System을 사용한 AAV 생산.
그림 2. Hairpin RNA 발현 벡터
AAVpro® Helper Free System (AAV-U6-ZsGreen1) 시리즈 (Code 6670, 6658, 6659, 6660, 6685, 6695)는 shRNA 발현과 함께 CMV 프로모터로부터 녹색 형광 단백질인 ZsGreen1도 발현하므로 이를 통해 세포 내 도입여부를 확인하고 도입세포를 선별할 수 있다.
AAVpro® Helper Free System (AAV-2xU6) 시리즈 (Code 6671, 6661, 6662, 6663, 6684, 6694)는 두 종류의 shRNA를 발현할 수 있어 두 개의 타겟에 대해 각각의 siRNA를 설계하거나 하나의 유전자를 타겟하는 두 개의 siRNA를 설계할 수 있다.
그림 3. shRNA 발현 AAV를 이용한 knockdown 효과 확인
GAPDH에 대한 발현을 조절하는 shRNA를 발현하는 재조합 AAV2 (pAAV-U6-shGAPDH-ZsGreen1)를 293T cell line에서 제작하고, AAVpro® Purification Kit Midi (Code 6675)로 정제하였다.
정제된 AAV를 293T cell line에 transduction하고 3일 후 세포의 GAPDH 발현량을 qPCR로 확인하였다. transduction 효율은 ZsGreen1 발현을 지표로 flow cytometry 분석하였고, MOI-dependent 유전자 도입 및 GAPDH 유전자의 knockdown을 확인하였다. qPCR을 통한 GAPDH 정량은 Human Housekeeping Gene Primer Set (Code 3790)의 primer (internal standard를 GAPDH 및 GSUB2로 사용)를 사용하여 수행하였고, transduction되어 ZsGreen1을 잘 발현하는 세포일 수록 GAPDH의 RNAi 효과가 높게 확인되었다.
구성
AAVpro® Helper Free System (AAV2-2xU6) (Code 6661)
1. |
pAAV- 2xU6 Vector (1 ㎍/㎕) |
20 ㎕ |
2. |
pRC2-mi342 Vector (1 ㎍/㎕) *1 |
20 ㎕ |
3. |
pHelper Vector (1 ㎍/㎕) |
20 ㎕ |
4. |
AAV Extraction Solution A |
1.5 ㎖ × 3 |
5. |
AAV Extraction Solution B |
150 ㎕ × 3 |
*1 다른 AAVpro® Helper Free System에도 각 serotype에 해당하는 pRC Vector가 함께 제공
AAVpro® Helper Free System (AAV2-U6-ZsGreen1) (Code 6658)
1. |
pRC2-mi342 Vector (1 ㎍/㎕) *2 |
0.5 ㎖ × 2 |
2. |
pHelper Vector (1 ㎍/㎕) |
0.5 ㎖ × 2 |
*2 다른 AAVpro® Helper Free System에도 각 serotype에 해당하는 pRC Vector가 함께 제공
Vector 서열 (vector명 클릭 시 .fasta data 다운 가능)
pAAV-2xU6 (fasta data) |
6671, 6661, 6662, 6663, 6684, 6694 내 포함 |
pAAV-U6-ZsGreen1 (fasta data) |
6670, 6658, 6659, 6660, 6685, 6695 내 포함 |
pHelper (fasta data) |
모두 포함 |
pRC1 (fasta data) |
6671, 6670 내 포함 |
pRC5 (fasta data) |
6662, 6659 내 포함 |
pRC6 (fasta data) |
6663, 6660 내 포함 |
pRC2-mi342 (fasta data) |
6661, 6658 내 포함 |
pRC8 (fasta data) |
6684, 6685 내 포함 |
pRC9 (fasta data) |
6694, 6695 내 포함 |
보관
- 20 ℃
단, AAV Extraction Solution A및 AAV Extraction Solution B는 융해 후, 실온 보관
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