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약 4시간만에 간단하고 정밀하게 Knock-in editing 검출

Knock-in Screening Kit

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제조사 제품코드 제품명 용량 가격
(부가세별도)
비고 사용자매뉴얼
Clontech
632659
Guide-it™ Knockin Screening Kit
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100회
565,600원 
707,000원
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11.01 ~ 12.13
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Guide-it%20Knockin%20Screening%20Kit%20User%20Manual_082619.pdf
Clontech
632660
Guide-it™ Knockin Screening Kit
관련학술 관심상품등록 구매하기
400회
1,440,800원 
1,801,000원
가격할인
11.01 ~ 12.13
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  • [FAQ] Knock-in (Homology-directed repair) (클릭)
  • [Tool] Oligo design tool for Guide-it SNP screening assays (클릭)

  • Genome Editing 이후 생성된 염기치환 (nucleotide substitution) 또는 삽입 (insertion) 변이를 정확하고 민감하게 검출
  • 게놈의 위치 (genomic locus), Edit 종류에 관계없이 적용 가능
  • Heterogenous population (bulk-edited) 또는 clonal cell population에서 Knock-in 검출
  • Dual-color를 이용하여 heterozygous clone으로부터 두 종류의 allele (SNP and WT)을 동시에 검출 가능
  • 간단한 실험장비를 이용하여, 단 4시간만에 실험이 가능한 간단하고 빠른 워크 플로우
  • 분석용 올리고 디자인을 위한 온라인 툴 제공
제품설명
Guide-it™ Knockin Screening Kit는 mixed 또는 clonal cell population에서 CRISPR/Cas9과 같은 유전자 편집기술로 생성된 Homologous recombination (HR) 유전자 편집 결과를 검출할 수 있다. 본 제품은 Knock-in 유전자의 길이에 관계없이 (단일염기 치환, 긴 길이의 유전자 삽입), 그리고 편집부위 주변의 유전적 위치나 서열에 관계없이 안정적으로 Knock-in 편집을 검출할 수 있는 “형광 기반의 검출 방법 (fluorescence-based method)”을 이용한다. 이를 이용하면 목적유전자부위의 PCR 증폭 및 녹색, 적색의 형광 발광을 유도하는 효소 반응을 통해 간단하고 빠르게 Knock-in을 검출할 수 있다.
본 제품을 이용 시, 형광 검출을 위해 표준 형광 검출기 (standard fluorescence plate reader) 또는 qPCR 장비 이외의 다른 특수 장비는 필요하지 않다. 또한 전반적인 실험과정을 완료하는 데 약 4시간의 짧은 시간이 소요되며, 최종 형광 시그널 검출 결과는 목적유전자의 편집 결과와 연관이 있다. 본 제품을 이용하면 SNP 편집과 같은 실험의 경우, 서로 다른 두 개의 allele을 포함하고 있는 heterozygous clone (예를 들어, SNP와 WT)을 확실하게 식별할 수 있으며, 길이가 긴 유전자의 knock-in의 경우, 삽입된 서열의 5’ 말단, 3’ 말단부를 인식할 수 있다 (그림 1., 그림 2.).


그림 1. Guide-it™ Knockin Screening Kit을 이용한 SNP 분석 방법
This example workflow demonstrates analysis of a G>A substitution, where G is the wild-type base edited to an A. After genome editing, single cells expanded to clonal cell lines can have several different genotypic outcomes at the genomic target site of interest. After PCR amplification of the target site, the PCR product is annealed simultaneously with different oligo probes: a displacement oligo (purple) in combination with either flap-probe oligo A (green; encoding the SNP allele, A) or flap-probe oligo B (orange; encoding the WT allele, G). After the annealing of the oligos to the PCR products, the Guide-it Flapase enzyme (indicated with scissors) recognizes a complete base pairing and cleaves the 5′ portion of the flap-probe oligo (shaded green or orange). The cleaved flaps are then detected by corresponding Guide-it flap detectors, which yield green or red fluorescent signals, respectively. In the example above, analysis of a clonal cell line that is homozygous WT (G/G) at the site of interest yields only a red signal, while analysis of a heterozygous clone carrying both edited and WT alleles (G/A) yields both red and green signals.


그림 2. Guide-it™ Knockin Screening Kit을 이용한 full-length knock-in 결과 검출 방법
After the genome editing event, bulk-edited population or clonal cell lines isolated via FACS or limiting dilution may carry wild-type, indel, or full-length insertions. After DNA extraction from the clonal cells and subsequent PCR amplification of the target site, the PCR product is annealed with two different sets of displacement and flap probes: one that hybridizes with the 5' end of the insert (Flap-probe oligo A; green), and the other with the 3' end (Flap-probe oligo B; orange). If the full-length HR event has been successful and seamless, the full hybridization of the probes at both termini will generate both green and red fluorescent signals after the cleavage of the respective flap probes by the Guide-it Flapase. Detection of only one signal (red or green) indicates an insertion truncated on either the 5' or 3' end, respectively. The lack of fluorescence is indicative of the presence of the wild-type sequence or an indel at the target site.


그림 3. Detection of precise editing at the PSEN1 locus in a bulk-edited iPS cell population
To demonstrate the SNP-detection capabilities of the Guide-it Knockin Screening Kit, we used CRISPR/Cas editing technology to generate an iPS cell line heterozygous for a variant of the PSEN1 gene encoding an A>G substitution (M164V) associated with early-onset Alzheimer's disease.
Panel A. HDR templates carrying silent PAM mutations used to perform precise editing at the PSEN1 locus. Panel B. Detection of successful HDR in bulk-edited iPS cells. (데이터 자세히보기)


그림 4. Common outcomes when engineering SNPs
An example of a single-nucleotide edit (G>T) is shown. Panel A. Outcomes at the genomic target site. When cleavage fails to occur at the target site or is followed by accurate, nonhomologous end joining (NHEJ)-based repair, the result is the wild-type (WT) sequence. When cleavage is followed by inaccurate NHEJ-based repair, the result is an insertion or deletion (Indel) at the target site possibly causing a knockout (KO, a highly probable outcome). When cleavage is followed by accurate HDR, a SNP is introduced at the target site. Panel B. Combined allelic outcomes in diploid cells. When editing is performed in diploid cells, the outcomes for each allele can vary, generating multiple possible combinations. Cells can remain homozygous (Wild type; top), they can have one or both alleles modified via inaccurate NHEJ (Indel; middle), or they can have one or both alleles modified with the desired SNP (Successful HDR; bottom).
구성품 및 보존 (자세한 내용은 CoA를 참조 바랍니다)
  • Store MightyPrep Reagent for DNA at 4°C
  • Store all other reagents at -20°C

Guide-it™ Knockin Screening Kit

632659
(100 rxns)

632660
(400 rxns)

MightyPrep Reagent for DNA (Store at 4°C)

9182A

9182

MightyPrep Reagent for DNA

5 ㎖

20 ㎖

Guide-it Knockin Control Set (Store at -20°C)

632661

632661

Guide-it Knockin Positive Control Mix

300 ㎕

300 ㎕

Guide-it Knockin Negative Control Mix

300 ㎕

300 ㎕

Guide-it Flap Reagents (Store at -20°C)

632662
(100rxns)

632663
(400rxns)

Terra PCR Direct Polymerase Mix

50 ㎕

200 ㎕

2X Terra PCR Direct Buffer (with Mg2+, dNTP)

750 ㎕ x 2

1 ㎖ x 5

Dilution Buffer

8 ㎖

32 ㎖

RNase-free Water

20 ㎖

35 ㎖ x 2

Annealing Buffer

200 ㎕

800 ㎕

Flapase Buffer

300 ㎕

1.2 ㎖

Guide-it Flapase

100 ㎕

400 ㎕

Guide-it Green Flap Detector (40X)

50 ㎕

200 ㎕

Guide-it Red Flap Detector (40X)

50 ㎕

200 ㎕







Keyword : CRISPR,크리스퍼,Knock-in,knockin,HDR,SNP,HR,유전자편집,Subsititution,insertion,삽입,유전자삽입,632652,632653
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