• 극소량 샘플에서 뛰어난 감도로 Oxford Nanopore Technologies (ONT)로 long read sequencing 가능
• 세포 (1~1,000 개) 또는 total RNA (10 pg~100 ng)에서 바코드가 부착된 long read용 cDNA 합성
• 고품질 long read sequencing 데이터 - 평균 read 길이 최대 2 kb (N50)를 확보, 8 kb 이상의 full-length transcripts 감지
• Seamless integration of barcodes - Single-tube long read library용 cDNA를 최대 96개 multiplex 가능
• Streamlined sample demultiplexing - ONT 시스템의 basecaller와 호환되는 편리하고 효율적인 워크플로우

제품설명

SMART-Seq^® mRNA Long Read는 long read sequencing용 cDNA를 합성하는 제품으로 특히 극소량 샘플에서 whole transcriptome 해석에 적합하다. 10 pg~100 ng의 total RNA (RIN>8) 또는 1~1,000개의 intact cell에서 oligo dT primer를 이용해 full-length cDNA를 합성하고 이어 barcoded primer를 이용해 cDNA를 증폭함으로써 최대 96개의 barcoded cDNA library를 제작할 수 있다. Oxford Nanopore Technologies (ONT) 플랫폼에서 adapter ligation, library preparation (Ligation Sequencing Kit V14, Code SQK-LSK114) 및 long read sequencing을 수행할 수 있다. 본 제품을 통해 low input 샘플의 ONT library preparation을 위한 multiplexing이 가능하며, 약 2 kb의 평균 read-length (N50)를 안정적으로 생성하고 8 kb이상의 full-length transcripts 분석이 가능하다.

ONT library preparation을 위한 cDNA 합성, 바코드 부가, 농축 및 바코드가 부착된 cDNA pooling 등을 포함한 전체 프로토콜을 1.5일 이내에 완료할 수 있으며, 자동화 및 small scale 모두에 적합하다. 본 제품으로 수집한 데이터는 당사에서 제공하는 프로토콜과 파일을 사용하여 쉽게 demultiplexing이 가능하며, ONT 사의 Dorado basecaller와 함께 사용할 수 있다.
cDNA 합성은 SMART (Switching Mechanism At 5’ End of RNA Template)법을 사용하여 높은 효율로 full-length cDNA 합성 및 transcript isoforms, gene fusion, point mutations 등의 분석이 가능하다. SMART법은 감도와 재현성이 매우 높기 때문에 샘플의 input 양이 적을 경우에도 다른 방법에 비해 더 많은 유전자를 식별할 수 있다. 본 제품을 이용하면, 높은 재현성, 균일한 커버리지 및 GC-rich transcripts의 정확한 검출이 가능하다.


그림 1. SMART-Seq^® mRNA Long Read kit의 워크플로우
SMART법을 사용하여 full-length cDNA를 합성하고 PCR로 cDNA를 증폭한다. 샘플을 pooling하고 ONT사의 Ligation Sequencing Kit V14 (Code SQK-LSK114)를 이용해 말단 처리, adapter 부가, sequencing을 실시한다. Sequencing 후, ONT사의 Guppy를 사용해 basecall 및 demultiplexing을 실시하고 Cutadapt, Minimap2, SAMtools, Bedtools, Salmon 등을 이용해 데이터를 해석한다.


그림 2. SMART-Seq^® mRNA Long Read에 의해 합성된 barcoded cDNA 크기 분포
SMART-Seq^® mRNA Long Read를 이용해 10 pg과 10 ng mouse brain total RNA (n=8)로부터 cDNA를 합성하고 Agilent High Sensitivity DNA Kit를 이용해 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)로 cDNA의 크기 분포를 측정했다. (A) barcoded cDNA는 input별로 pooling 하였고, Ligation Sequencing Kit V14를 이용해 library prep 후 MinION Flow Cell에서 72시간 sequencing 하였다. ONT 사의 Guppy를 이용해 basecall 및 demultiplexing 후 MS-Excel을 이용해 read-length 분포를 시각화 하였다. (B) 10 pg 및 (C) 10 ng의 mouse brain total RNA의 대표적인 샘플의 read-length 분포를 표시하였다.


그림 3. SMART-Seq^® mRNA Long Read에 의해 제조된 library read의 광범위한 분포 및 높은 감도
mRNA Long Read를 이용해 10 pg과 10 ng의 mouse brain total RNA로부터 cDNA를 합성해 library를 제조했다. Sequencing 후, ONT사의 Guppy를 이용해 basecall 및 demultiplexing 후 각각의 바코드 당 400,000 read로 다운샘플링하였다. (A) Library의 total read 분포는 어느 input 양에서도 일관된 성능을 보여준다. (10 ng의 경우 n=8, 10 pg의 경우 n=7) (B, C) 유전자 및 전사 산물의 검출 감도를 평가하기 위해 다운샘플링하여 비교한 결과, (B) 10 pg, (C) 10 ng 모두 read depth에서 고감도로 유전자 (Genes) 및 전사체 (Transcripts)가 검출되었다.


그림 4. SMART-Seq^® mRNA Long Read의 커버리지
10 pg 및 10 ng의 MBR 샘플을 8회 반복하여 유전자 전체 coverage를 평가한 결과, 10 pg의 극소량 input에서도 높은 커버리지와 균일한 결과를 얻을 수 있었다.


그림 5. 세포 샘플에서 SMART-Seq^® mRNA Long Read에 의해 제조된 library read 분포 및 감도
SMART-Seq^® mRNA Long Read를 이용해 single cell과 1,000개의 K562 cell로부터 cDNA를 합성해 library를 제조했다. Sequencing 후, ONT사의 Guppy를 이용해 basecall 및 demultiplexing을 진행하였고 각각의 바코드 당 300,000 read로 다운샘플링하였다. (A) 평균 유전자 수를 막대그래프에 표시 (Single cell의 경우 n=8, 1,000개의 K562 cell의 경우 n=2) (B) 피어슨 상관관계를 계산 (single cell n=8의 유전자 matrix에서 산출) (C) Single K562 cell의 다운샘플링 분석 결과, read depth 당 유전자 (genes) 및 전사체 (transcripts) 수가 고감도로 검출되었다.


그림 6. SMART-Seq^® mRNA Long Read를 이용하면 full-length isoform과 gene fusion 검출 가능
SMART-Seq^® mRNA Long Read의 워크플로우에 따라 10 pg mouse brain total RNA와 K562 single cell에서 cDNA를 합성하여 library prep 및 sequencing을 수행했다. ONT 사의 Guppy를 이용해 basecall 및 demultiplexing 후 Minimap2를 이용해 alignment를 실시했다. 10 pg mouse brain total RNA에서 검출된 (A) Snap25와 (B) Nbr1의 full-length isoforms을 IGV로 시각화한 결과. (C) K562 single cell에서 검출된 NUP214::XKR3 gene fusions을 IGV로 시각화한 결과.

자세한 구성은 CoA를 참고하세요.