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FFPE 샘플의 single-stranded DNA도 NGS library 제작 가능

ssDNA-Seq Kit

-

제조사 제품코드 제품명 용량 가격
(부가세별도)		 비고 사용자매뉴얼
Takara
 NN0003
 ssDNA-Seq Kit
관련학술 구매하기 		24회
 2,409,000원  NN0003_NN0004_UM.pdf
Takara
 NN0004
 ssDNA-Seq Kit
관련학술 구매하기 		96회
 4,340,000원 

  • ssDNA와 dsDNA에서 Illumina 전용 NGS library 제작
  • 단편화 되거나 손상된 DNA (예, FFPE 샘플) 적용 가능
  • 극소량 DNA 샘플 (10 pg~ 250 ng) 및 ultra-short ssDNA (50 bases) 단편도 NGS 분석 가능
  • 2시간 이내에 library 제작이 가능한 간단한 워크플로우
  • Unique Dual Index Kit (별도 구매)와 같이 사용하면 384개의 샘플까지 multiplexing 가능
제품 설명
ssDNA-Seq Kit는 single-stranded DNA (ssDNA) 및 double-stranded DNA (dsDNA) 모두에서 DNA library 제작이 가능하며, FFPE DNA, environmental DNA, 손상되거나 분해된 DNA 샘플 등 dsDNA와 ssDNA가 모두 포함된 샘플에 적합한 제품이다. 따라서 기존의 dsDNA library 제작 과정에서는 손실되는 ssDNA까지 포착하여 고품질 library를 제작할 수 있다.
본 제품을 사용하면 극소량 DNA (10 pg~)와 짧은 ssDNA (약 50 bases)에서 NGS 분석용 library 제작이 가능하다. 기존의 dsDNA-seq 워크플로우와 달리, ssDNA-Seq kit 워크플로우는 전처리 및 열 변성 단계를 통해 샘플 내 모든 DNA를 ssDNA로 변환 후, Single-Strand DNA Ligase (SDL)를 사용하여 모든 ssDNA 단편 3’ 말단에 첫 번째 어댑터를 추가한다. 어댑터를 인식하는 프라이머를 사용하여 신장 반응을 실시하고, 합성된 dsDNA의 5’ 말단에 두 번째 어댑터를 추가한 후 Unique Dual Index Kit (별도 구매)를 사용하여 library를 증폭한다. 전체 실험 과정은 2시간 이내로 완료할 수 있다.

[기존 dsDNA-seq kit에 적용이 어려웠던 샘플도 ssDNA-seq kit에 적용 가능]

DNA type

DNA form

ssDNA-Seq kit 적용

Traditional dsDNA library prep kit 적용

dsDNA

O

O

ssDNA

O

X

dsDNA with nicks/gaps

O

X

dsDNA with 5’ overhangs

O

X

dsDNA with 3’ overhangs

O

X

[ssDNA-Seq Kit에 적용 가능한 샘플]
: ssDNA, dsDNA, ssDNA와 dsDNA가 혼합된 샘플 모두 적용 가능

 

조건

샘플 type

ㆍGenomic DNA (gDNA)
ㆍcell-free DNA
ㆍFFPE 샘플 유래 DNA
ㆍAncient DNA
ㆍEnvironmental DNA
ㆍViral genome DNA
ㆍShort DNA
ㆍSynthetic oligo
ㆍDNA aptamer

DNA 사이즈

50 ~ 600 bp (50 ~ 600 bases)

Input 양

10 pg ~ 250 ng

Input 용량

최대 18 ㎕

전처리 시 사용 buffer

TE buffer (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA)


그림 1. ssDNA-Seq Kit 워크플로우


그림 2. ssDNA-Seq Kit와 ThruPLEX® Tag-Seq HV (기존 제품)의 ssDNA 및 dsDNA로부터의 library 제작 결과 비교
ssDNA synthesis oligo 200 bases와 dsDNA synthesis oligo 200 bp를 혼합하여 ssDNA-Seq Kit와 ThruPLEX® Tag-Seq HV (기존 제품)로 DNA library를 제작하였다. NextSeq 2000으로 paired-end sequencing (2×150 bp)을 실시했으며, Bowtie2를 사용하여 각각의 reference 서열에 정렬하였다. 그 결과, ThruPLEX® Tag-Seq HV 사용 시 dsDNA로부터 제작된 library의 높은 mapping 효율을 확인하였고, ssDNA-Seq Kit는 dsDNA뿐만 아니라 ssDNA 모두 library 제작이 가능한 것을 확인하였다.

단편화가 진행된 FFPE 유래 DNA sample의 library 분석 결과
본 제품으로 Human Genomic DNA 10 ng, 손상된 정도가 다른 FFPE 유래 DNA 10 ng 및 혈장에서 추출한 cell-free DNA 10 ng의 DNA library를 제작하였다. NextSeq 2000으로 paired-end sequencing (2×150 bp)을 실시하여 총 100만 개의 read로 다운샘플링하였고, Bowtie2와 Picard를 사용하여 분석하였다. 그 결과, Human Genomic DNA와 손상된 DNA (FFPE 샘플과 cell-free DNA)에서 모두 97% 이상의 높은 mapping 효율을 보이며 고품질 sequencing 결과를 확인할 수 있었다.

표1. 손상된 DNA와 Human Genomic DNA를 이용한 library 분석 결과

Sample

Total reads aligned

Mapping (％)

Duplicate (%)

Chimera (%)

Library yield (ng)

Human Genomic DNA

9.79×105

98.59

0.77

0.79

1,088

DNA from FFPE sample

DIN:4.9

9.78×105

98.39

0.95

0.85

560

DIN:3.8

9.75×105

98.18

0.88

1.10

395

DIN:2.6

9.76×105

98.22

0.94

1.21

394

DIN:1.6

9.62×105

97.14

0.95

1.25

101

Cell-free DNA

9.82×105

98.82

0.92

1.61

468

Total reads aligned: reference genome sequence에 정렬된 read 수
Mapping (%): reference genome sequence에 정렬된 read의 비율
Duplicate (%): PCR에 의한 library 제작 시 발생하는 동일한 서열의 DNA fragment에서 유래한 read의 비율
Chimera (%): genome의 두 개의 서로 다른 부위에서 정렬된 read의 비율
내용

 

 

NN0003

NN0004

Preparation enzyme

24 ㎕

96 ㎕

Preparation buffer

48 ㎕

192 ㎕

TE buffer

1 ㎖×3

6 ㎖×2

SDL enzyme

48 ㎕

192 ㎕

SDL buffer

600 ㎕

1.2 ㎖×2

SDL adapter

24 ㎕

96 ㎕

Extension polymerase Premix

600 ㎕×2

1.2 ㎖×4

Extension primer

24 ㎕

96 ㎕

VDC enzyme

24 ㎕

96 ㎕

VDC buffer

150 ㎕

600 ㎕

PCR polymerase Premix

600 ㎕

1.2 ㎖×2
* TE buffer의 component 색은 다음과 같다.
* NN0003: (흰색)
* NN0004: 색 없음
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