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Cloned

T4 DNA Polymerase

제조사	제품코드	제품명	용량	가격 (부가세별도)	비고	사용자매뉴얼
Takara	2040A	T4 DNA Polymerase	100 U	94,000원
Takara	2040B	T4 DNA Polymerase	500 U (2040A x 5)	423,000원

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제품설명

본 효소는 주형 DNA와 primer가 존재할 때 dNTP를 기질로, 주형에 상보적인 DNA를 5’→3’ 방향으로 합성한다. Klenow Fragment에 비하여 약 100~1000배 강한 단일 가닥 DNA에 특이적인 3’→5’ exonuclease 활성이 포함되어 있지만 5’→3’ exonuclease 활성은 없다.

보존

-20℃

농도

5 U/㎕

형상

200 mM	Potassium Phosphate 완충용액 (pH6.5)
1 mM	DTT
50%	Glycerol

첨부 buffer 조성 (10x)

330 mM	Tris-acetate (pH7.9)
660 mM	CH₃COOK
100 mM	(CH₃COO)₂Mg
5 mM	DTT
0.1%	BSA [별첨]

활성의 정의

37℃, pH8.8에서 열 변성 송아지 흉선 DNA를 주형 및 primer로 하여 30 분간 10 nmol의 모든 nucleotide를 산성의 침전물로(acid-insoluble products) 합성하는 효소활성을 1 U으로 한다.

활성 측정용 반응액 조성

67 mM	Tris-HCl (pH8.8)
6.7 mM	MgCl₂
16.6 mM	(NH4)₂SO₄
1 mM	DTT
6.7 μM	EDTA
0.0167%	BSA
0.2 ㎎/㎖	기질 DNA
각 330 μM	dCTP, dATP, dGTP
330 μM	[³H]GTP

사용상의 주의

- 효소 활성을 위해서 Mg²⁺가 필요하고, 최대 활성을 위해서는 SH 환원제를 첨가한다.
- 반응 전체의 이온이 100 mM을 넘을 경우 반응이 저해된다.
- 10x 첨부 buffer에 0.1% BSA를 바로 넣을 경우 대량의 백색 침전이 생기므로 반응액을 조제할 때 다음의 순서로 시약을 첨가한다.
멸균 정제수 → 10x 첨부 buffer → 0.1% BSA → 기질 DNA

용도

- DNA 절편의 평활 말단화
- 3’→5’ exonuclease 활성을 이용한 replacement synthesis에 의한 DNA의 3’-말단 표식

기원

Escherichia coli carrying the plasmid containing phage T4 DNA polymerase gene

일반적 성질

- 분자량: 약 114,000
- Subunit
   단순한 polypeptide
   활성에 필수적인 15개의 cysteine기를 가지고 있다.
- 보조인자
   Mg²⁺ (최적농도: 6 mM), Mn²⁺ (최적농도: 0.1 mM, 6 mM Mg²⁺일때 활성의 1/4), SH시약 (2-mercaptoethanol, DTT 등)
- 활성화제: polymerase 활성은 T4 gene 32 산물에 특이적으로 증가하지만, exonuclease 활성은 포화량의 T4 gene 32 산물에 완전히 저해된다.
- 저해제: NEM
- 안정성: vortex 등의 격렬한 교반 시 불활성화 된다.
- 최적 염 농도: 100 mM (너무 높을 경우 반응이 저해된다. 200 mM에서 50mM의 5%의 활성을 보인다.)
- Polymerase 활성과 exonuclease 활성의 관계
다음의 3가지 조건이 갖추어 지면 polymerase 활성을 나타낸다.
   1. 주형
   2. 주형보다 적어도 1염기 짧은 3’-OH 말단 primer
   3. 주형에 상보적인 dNTP
이 중 1가지라도 없으면 exonuclease로 작용한다.

Keyword :

수식효소／DNA Polymerase、RNA Polymerase

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