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T4 RNA Ligase

제조사	제품코드	제품명	용량	가격 (부가세별도)	비고	사용자매뉴얼
Takara	2050A	T4 RNA Ligase	1,000 U	171,000원
Takara	2050B	T4 RNA Ligase	5,000 U	769,500원

Product index

농도 10~50 U/㎕

형상

20 mM	Tris-HCl (pH7.5)
50 mM	NaCl
5 mM	2-Mercaptoethanol
0.1 mM	EDTA
50%	Glycerol

보존 -20℃

첨부 Buffer 조성(10×)

500 mM	Tris-HCl (pH7.5)
100 mM	MgCl₂
100 mM	DTT
10 mM	ATP
0.1%	BSA [별첨]*

* BSA가 침전할 우려가 있으므로 동결·융해는 가능한 한 피해 주십시오.

기원

Escherichia coli B infected with T4 am N82

제품설명

본 효소는 ATP를 AMP와 PPi로 분해하여 그 에너지로 5’-P말단의 oligonucleotide와 3’-OH 말단의 oligonuceotide를 결합시키는 효소이다.
최소기질은 NpNpNOH(3’-OH oligomer, 수용체), pNp(5’, 3’DP monomer 공여체)이다. 라이게이션 효율은 수용체, 공여체 각각의 염기에 영향을 받으며, 일반적으로 수용체에는 purine을, 공여체는 pyrimidine을 포함하는 것이 효율이 좋다. DNA는 RNA보다 상당히 효율이 떨어지고, 구조적으로 3’말단에 가까운 P 말단을 갖는 RNA도 효율이 좋지 않으며, 3’- uridine oligomer 또한 수용체로써 부적당하다. 3’수용체의 경우는 BAP처리에 의하여 효율을 높일 수 있다.
5’, 3’DP monomer 공여체로써는 C ＞ U ＞ A ＞ G의 순으로 높은 효율을 가지고 있다.

활성의 정의

Oligo(A)n을 기질로 하여 5℃, 10분동안 1 pmol의 [5’-³²P]pCp를 산불용성 침전물로 사용하는 것을 효소활성 1 U로 한다(RNA 3’말단 표식반응).

활성측정용 반응액 조성

50 mM	HEPES-NaOH Buffer (pH7.5)
20 mM	MgCl₂
3.3 mM	DTT
6 μM	ATP
0.001%	BSA
10%	DMSO
1.2 μM	3’- OH RNA
2.4 μM	[5’-³²P]pCp

순도

- 100 U의 본 효소와 1 ㎍의 λDNA-Hind III 분해물을 37℃, 24시간 반응해도 DNA의 전기영동 패턴에 변화가 없다.
- 100 U의 본 효소와 1 ㎍의 16S와 23S rRNA를 37℃, 24시간 반응하여도 RNA의 전기영동 패턴에 변화가 없다.
- 20 U의 본 효소와 6 ㎍의 λDNA-Hind III 분해물 또는 6 ㎍의 λDNA-Pst I 분해물을 37℃, 24시간 반응하여도 각 DNA는 T4 DNA ligase에 의해 90%이상 연결되고, 그중 100%가 각각 Hind III 또는 Pst I에 의해 재절단된다.

사용상의 주의

- 4℃ 이하 보존에서 약 1년간 안정하다.
- 분자간 라이게이션의 최적반응 온도는 5~15℃로, 그 이상 높아지면 억제된다.
- PEG 공존하에서 반응은 촉진되나, 반응특이성에는 변화가 없다.
- 연결반응의 효율을 높이기 위해서는 효소농도는 높고 ATP 농도는 기질농도를 고려하여 가능한 낮게 하는 것이 좋다.
- 10× 첨부 버퍼에 0.1% BSA를 직접 첨가하면 다량의 백색침전이 생기므로 반응액을 조제할 때는 다음의 순서로 시약을 첨가한다.
dH₂O → 10× 첨부 버퍼 → 0.1% BSA → 기질 RNA 또는 DNA

용도

- 단일가닥 RNA와 단일가닥 DNA의 3’-OH 말단의 표식
- 단일가닥 oligo RNA, 단일가닥 DNA의 합성
- 완전한 길이의 cDNA 합성

참고

Yeast tRNA^phe를 기질로 하였을 때, 상기 반응액 중에 50 U의 본 효소를 5℃, 16시간 처리하면 80% 이상 tRNAphe의 3’말단이 표식된다.

Keyword :

수식효소／Ligase

Cloned

E. coli DNA Ligase

Cloning용 ligase

T4 DNA Ligase

T4 RNA Ligase