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Cloned

Klenow Fragment (Large Fragment E. coli DNA Polymerase I)

제조사	제품코드	제품명	용량	가격 (부가세별도)
Takara	2140A	Klenow Fragment (Large Fragment E. coli DNA Polymerase I)	200 U	95,000원
Takara	2140B	Klenow Fragment (Large Fragment E. coli DNA Polymerase I)	1,000 U (2140A x 5)	427,500원
Takara	2140AK	Klenow Fragment (Large Fragment E. coli DNA Polymerase I)(2 U/μl)	200 U	95,000원
Takara	2140BK	Klenow Fragment (Large Fragment E. coli DNA Polymerase I)(2 U/μl)	1,000 U (2140AK x 5)	430,000원

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제품설명

본 효소는 주형 및 primer(DNA, RNA 모두 가능)가 존재할 때 dNTP를 기질로, 주형에 상보적인 DNA를 5’→3’ 방향으로 합성한다. 본 효소는 E. coli DNA polymerase I의 구조유전자 pol A의 시작코돈에서 하류 1,000 bp를 결실한 단편을 대장균에 cloning하여 생산하고 있다. 따라서 3’→5’ exonuclease 활성은 가지고 있지만 5’→3’ exonuclease 활성은 가지고 있지 않다.
Code 2140AK, 2140BK 제품은 Kilo-Sequence 용 Deletion Kit(Code 6030)용으로 농도를 맞추고 형상 조성의 일부를 Glycerol에서 Ethylene Glycol로 바꾸어 sequencing gel 전기영동시 왜곡 없이 깨끗한 전기영동 결과를 얻을 수 있도록 한 것이다.

보존

-20℃

농도

- 5 U/㎕ (Code 2140A/B)
- 2 U/㎕ (Code 2140AK/BK)

형상

(Code 2140A/B)

50 mM	Potassium Phosphate (pH6.5)
1 mM	DTT
50%	Glycerol

(Code 2140AK/BK)

50 mM	Potassium Phosphate (pH6.5)
1 mM	DTT
50%	Ethylene Glycol

첨부 buffer 구성 (10x)

(Code 2140A/B)

100 mM	Tris-HCl (pH7.5)
70 mM	MgCl₂
1 mM	DTT

주의) Code 2140AK/BK에는 반응용 버퍼가 첨부되어 있지 않습니다.

활성의 정의

37℃, pH7.4에서 Poly d(A or T)를 주형 및 primer로 사용할 때 30 분간 모든 10 nmol의 nucleotide를 산성의 침전물로(acid-insoluble products) 바꾸는 효소 활성을 1 U으로 한다.

활성 측정용 반응액 조성

67 mM	Potassium Phosphate (pH7.4)
6.7 mM	MgCl₂
0.1 mM	DTT
20 μM	주형 DNA
33 μM	dATP
33 μM	[³H]dTTP

사용상의 주의

- 본 효소는 희석에 의한 활성의 저하가 일어나지는 않으나, 심하게 교반하면 실활될 수 있다.
- 5’→3’ exonuclease 활성을 포함하고 있지 않으므로 nick translation 활성을 보이지 않는다.
- DNA polymerase I과 같이 ddNTP를 저해없이 기질로 사용한다.
- T4 DNA Polymerase에 비해서 주형 DNA의 고차구조에 대한 저항성이 높다.
- DNA와 친화성이 강하기 때문에 과량을 사용하면 aggregation이 일어나 반응이 저해될 수 있다.
- 5’-돌출말단에 사용하면, filling 후에 1염기를 추가로 부가하는 경우가 있다.

용도

- Dideoxy법에 의한 염기서열 결정 (sequencing, sanger법)
*이 경우 2140AK/BK 제품이 적합하다.
- 이중 가닥 DNA 말단의 평활화
- Oligonucleotide directed mutagenesis의 이중 가닥 DNA 합성
- Random primer를 사용한 DNA 표식

기원

Escherichia coli carrying the plasmid which encodes the gene of Klenow fragment

촉매하는 반응

(1) 5'→ 3' DNA polymerase활성
주형 및 primer(DNA, RNA함께 가능)가 존재할 때 dNTP를 기질로, 주형에 상보적인 DNA를 5'→3'방향으로 합성.

ddNTP에 의한 저해가 잘 일어나지 않아 M13 dideoxy법에 의한 sequencing에 사용된다.

(2) 단일가닥 특이적 3'→ 5' exonuclease활성

Klenow의 3’→5’ exonulcease 활성은 상대적으로 약하기 때문에 (T4 polymerase의 1/100~1/1000) 3’-돌출말단의 평활화에는 적합하지 않다.

일반적 성질

- 분자량: 약 68,000
- Subunit: 1개의 Zn²⁺을 가진 1분자의 single stranded polypeptide
- 최적 pH: pH7.4
- 보조인자: Mg²⁺
- 안정성: Vortex 등의 격렬한 교반 과정에서 불활성화된다.

Keyword :

수식효소／DNA Polymerase、RNA Polymerase

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DNA Polymerase I (E. coli )

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Klenow Fragment (Large Fragment E. coli DNA Polymerase I)

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