• 4시간 이내에 Recombinant Retrovirus의 RNA titer를 측정
• 하루만에 바이러스 회수부터 titer 측정과 transduction 가능
• MMLV 기반의 Retroviral vector에 사용 가능 (* MSCV 기반의 Retrovirus에는 사용 불가)
• 정확한 titer를 얻을 수 있으며 안정된 실험이 가능

Retro-X qRT-PCR Titration Kit를 이용하면 recombinant retrovirus의 titer값을 신속, 간편하고 정확하게 측정 할 수 있다. 간단하게 RNA 정제를 실시 한 후, One-Step qRT-PCR을 이용하여 시료와 control RNA (kit에 제공)를 serial dilution하고, 희석된 시료의 copy수를 standard curve의 Ct 값과 비교하여 간단하게 역가를 결정할 수 있다. (그림1).



그림1. Flowchart of the procedure used for titrating retroviral supernatants with the qRT-PCR titration kits.

단시간의RNA titer측정에 의해 재현성이 높은 감염 실험이 가능

감염성을 기본으로 한 표준적인 titer 측정법에는 형광마커, 약제내성, 세포염색을 이용한 방법이 있지만, titer를 측정하는데 2~10일정도 소요된다.(그림2). 가장 신속하게 역가를 측정 할수 있는 방법인 flow cytometery를 이용하더라도 48시간 미만에서는 정확하게 측정 할 수 없다.
이러한 표준적인 titer 측정법은 장시간을 필요로 하기 때문에 반복적인 동결 해동 또는 장기간 보관 할 수밖에 없다. 그 사이에 바이러스의 감염성이 저하 될 수 있다. 하지만 저하되는 정도는 측정 할 수 없기 때문에 많은 경우 몇일이 지난 추정 titer를 이용하여 감염성과 MOI(multiplicity of infection)의 산출에 사용하게 된다.



그림2. Lenti-X and Retro-X qRT-PCR Titration Kits offer the fastest titration methods. Standard transduction-based titration methods require up to 10 days to complete. The Lenti-X and Retro-X qRT-PCR Titration Kits require only 4 hr, which enables virus harvest, titration, and infection of target cells to all be performed on the same day.

표준적인 형질 도입에 의한 titer측정법은 최장 10일이 필요하다. 하지만 Retro-X qRT-PCR Titration Kit를 이용하면 불가 4시간이 소요되기 때문에 바이러스의 회수, 역가 측정 및 타겟 세포에 감염까지 하루 만에 실시 할 수 있다. 신속하게 바이러스의 역가를 측정하므로서 바이러스 역가의 저하를 방지하며, 의도한대로 MOI 및 형질도입을 할 수 있으며, 재현성 높은 결과를 얻을 수 있다.



그림 3. Expression increases with higher MOIs. Histogram plots of NIH 3T3 cells transduced with increasing amounts of supernatant containing an amphotropic retrovirus that expresses the ZsGreen1 fluorescent protein. Greater amounts of virus increase the number of infected cells expressing ZsGreen1. Panels A-C. MOIs of 0.3, 3, and 30, respectively, resulted in 8%, 50%, and 97% ZsGreen1-positive cells having a fluorescence intensity greater than 10 (M1 population).

qRT-PCR역기 측정법

본 제품은 200 회의 qRT-PCR반응을 수행할 수 있는 반응 시약과 발현 되어지는 서열 (cDNA나 shRNA)과 상관없이 HIV-1기반의 lentivirus 또는 MMLV 기반의 retroivirus vector 양쪽 모두에 사용할 수 있는 역가 측정용 primer set로 구성되어 있다. Vector가 다양해도 기본 골격 구조가 동일하여 검출방법이나 selectable marker를 변경하지 않고도 한번에 역가를 측정할 수 있으며, viral RNA 정제와 DNaseI 처리 단계를 통하여 잔존 가능성이 있는 plasmid DNA를 제거하여 일시적 transfection으로부터 생성된 바이러스들을 최소한의 시료를 사용하여도 정확하게 정량할 수가 있다.



그림4. The qRT-PCR retroviral titration kit has a wide dynamic range. Panel A. Amplification plots of a qRT-PCR titration of the Retro-X RNA Control Template from 10⁹-10⁴ copies using the Retro-X qRT-PCR Titration Kit. The assay shows a dynamic range of at least six orders of magnitude with low No-Template-Control (NTC) background. Panel B. A standard curve of the titration from Panel A demonstrates a strong linear correlation between Ct and the RNA copy number (log scale), with R² = 1.000 and a PCR efficiency of 107.4%.

Components & Storage Conditions